snabb Oxidation av cystein till cystin i vattenlösningar – implikationer för använt Mediaanalys

Ladda ner denna anteckning (PDF)

Cysteinoxidation i cellodlingsmedier

Cellodlingsmedier ger vanligtvis alla aminosyror som är nödvändiga för celler att växa. Begränsningar i en eller flera aminosyror resulterar inte bara i suboptimal tillväxt av cellkulturer, utan påverkar också produktutbytet och kvaliteten negativt. Under processutveckling bidrar spenderad medieanalys till att övervaka aminosyrakoncentrationer och bestämma konsumtionshastigheter för att upptäcka och undvika sådana begränsningar.

detta är särskilt utmanande vid cystein, eftersom det lätt oxideras för att bilda cystin, en dimer av två cysteinmolekyler, anslutna via en disulfidbro. Nyligen rapporterade ett papper dedikerat till temperatur och lagringsstabilitet hos cellodlingsmedier också att aminosyran cystein var särskilt instabil under de testade förhållandena (Krattenmacher et al., 2018). Detta är i enlighet med vår erfarenhet, eftersom vi ofta mäter inga eller bara spår av cystein, medan cystin – dess oxiderade form – tydligt detekteras. Vi genomförde experiment som undersökte redoxbeteendet hos cystein och cystin i vatten, med tanke på att de mer komplexa förhållandena som finns i (förbrukade) cellodlingsmedier kan underlätta mer komplex Kemi.

omvandling av cystein till cystin i vatten

för att lära oss mer om cystein (in-)stabilitet beredde vi en 1 mM lösning i vatten, lagrade den vid rumstemperatur och tog prov vid olika tidpunkter. Vi tog flera prover under loppet av 26 h och sedan ett ”långsiktigt” prov efter 6 dagar. Varje prov derivatiserades direkt efter provtagning och mättes med hjälp av vår proprietära aminosyraanalysgradient på ett Agilent 1290 UHPLC-DAD-system. En lösning av 0,5 mM cystin behandlades på samma sätt och fungerade som en kontroll.

Som framgår av Tabell 1 och figur 1 innehöll även ett prov av en nyberedd cysteinlösning (0 h) detekterbara mängder cystin. Redan 11% av aminosyran var ursprungligen närvarande i form av dimeren. Detta värde var ganska stabilt under de första timmarna, möjligen för att cystein redan innehöll viss cystin före solubilisering. Efter 24 timmar hade mer cystein skiftat mot cystin vilket resulterade i 65% cystein och 35% cystin. Efter 6 dagar hade 98% av cystein transformerats till cystin (Figur 2).

till skillnad från cystein visade sig cystin vara stabil i lösning. Dess koncentration förblev konstant och ingen cystein kunde detekteras i något av kontrollproverna (se Tabell 2, Figur 1+2).

förutom de ovan beskrivna mätningarna behandlades alikvoter av cystein-och cystinlösningarna med DTT (ditiotreitol) eller TCEP (tris(2-karboxietyl)fosfin), två vanliga reduktionsmedel. Som visas i tabellerna 3 till 6 skyddade båda reagenserna cystein från oxidation till cystin och reducerade till och med cystin till fri cystein nästan helt. Reducerande effekter av TCEP var starkare jämfört med DTT.

slutsats

cystein är en vanlig beståndsdel i cellodlingsmedier, men detekteras ofta inte i prover av använt media på grund av dess instabilitet i vattenhaltiga lösningar. Experimentet som beskrivs i denna anteckning visar att cystein huvudsakligen oxideras för att bilda cystin. Oxidationen av cystein till cystin innebär också att cystein och cystin inte bör ingå i samma standardblandning. Istället kan individuella standarder för cystein framställas och skyddas från oxidation med hjälp av TCEP.dessutom observerade vi oxidationen av cystein för att fortsätta ännu snabbare i cellodlingsmedier spikade med ytterligare cystein (data visas inte). Detta måste beaktas när potentiella aminosyrabegränsningar analyseras genom spenderad medieanalys. Därför är det viktigt att ha lämpliga kvantifieringsmetoder på plats.

inklusive cystein och cystin ger vår metod för aminosyraanalys kvantitativa resultat för alla proteinogena aminosyror såväl som för etanolamin, citrullin, hydroxiprolin, ornitin och taurin. Kontakta oss för att begära mer information och testa den.

snabb och tillförlitlig aminosyraanalys

tabeller och figurer

fliken. 1

flik. 1: relativa mängder (rel. Amt.) av cystein och cystin i nyberedd 1 mM cystein i vatten, mätt med UHPLC-DAD efter derivatisering. Provtagningstiden visas i timmar / dagar efter beredning.

fliken. 2

flik. 2: relativa mängder (rel. Amt.) av cystein och cystin i nyberedd 0,5 mM cystin i vatten, mätt med UHPLC-DAD efter derivatisering. Provtagningstiden visas i timmar / dagar efter beredning.

flik. 3

flik. 3: relativa mängder (rel. Amt.) av cystein och cystin i nyberedd 1 mM cystein plus 0,5 mM DTT i vatten, mätt med UHPLC-DAD efter derivatisering. Provtagningstiden visas i timmar / dagar efter beredning.

flik. 4

flik.4: relativa mängder (rel. Amt.) av cystein och cystin i nyberedd 1 mM cystein plus 0,5 mM TCEP i vatten, mätt med UHPLC-DAD efter derivatisering. Provtagningstiden visas i timmar / dagar efter beredning.

flik. 5

flik.5: relativa mängder (rel. Amt.) av cystein och cystin i nyberedd 0,5 mM cystin plus 0,5 mM DTT i vatten, mätt med UHPLC-DAD efter derivatisering. Provtagningstiden visas i timmar / dagar efter beredning.

fliken. 6

flik.6: relativa mängder (rel. Amt.) av cystein och cystin i nyberedd 0,5 mM cystin plus 0,5 mM TCEP i vatten, mätt med UHPLC-DAD efter derivatisering. Provtagningstiden visas i timmar / dagar efter beredning.

Fig. 1

Fig. 1: Cystein / cystinmätningar 0h efter beredning av lösningarna. Den första rutan visar mätningar utan reduktionsmedel, den andra rutan dtt-reduktion och den tredje rutan TCEP-reduktion. Visas är uhplc-DAD-kromatogram med fokus på cystein-och cystintoppar uppmätta efter derivatisering.

Fig. 2

Fig. 2: cystein/cystinmätningar 6d efter beredning av lösningarna. Den första rutan visar mätningar utan reduktionsmedel, den andra rutan dtt-reduktion och den tredje rutan TCEP-reduktion. Visas är uhplc-DAD-kromatogram med fokus på cystein-och cystintoppar uppmätta efter derivatisering.

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.