Primärmeny

polymeraskedjereaktionen (PCR) har varit ett enormt viktigt laboratorieverktyg i årtionden. Subtila förändringar i enzymerna och drastiska förändringar i detektering av ett resultat har inträffat under det intervallet, men verktyget och dess tillförlitlighet har förblivit anmärkningsvärt konsekvent.

importerad POST *

det finns alltid kommentarer som den nedan som specifikt muses om upptäckten av MERS-CoV genetiskt material hos asymptomatiska eller mildt sjuka människor. De undrar i grunden på PCR: s pålitlighet.

När det gäller min kunskap definieras” infektion ” som bevis på ett infektiöst medel och beviset på multiplikation av detta medel inuti kroppen (eller associerat inflammatoriskt svar som kan kopplas till detta medel). Därför är min fråga: var togs provet från de” asymptomatiska ” sjuksköterskorna? PCR, som vi alla vet, upptäcker bara nukleinsyror. Så om multiplikation inte kan bevisas och inget lokalt eller systemiskt inflammatoriskt svar ges, hur utesluts ”kontaminering” (oavsett om det beror på inaktiverade delar av MERS-CoV eller till och med fullständiga viruspartiklar)? Detta är inte bara en semantisk fråga utan bör påverka det rapporterade antalet ”fall”.

Prof Martin Haditsch skriver i ProMED

känslan jag får av dessa är att vissa inte litar på PCR-resultaten eller kanske resultat getters. PCR-resultat ensam uppfyller inte ett behov av att se replikera virus i en värd innan du tilldelar någon form av kausal roll till det viruset. Men det är ofta opraktiskt och ofta onödigt eftersom ett positivt PCR-resultat i allmänhet är en pålitlig proxy för närvaron av aktiv virusinfektion.

att odla ett isolat skulle inte tilldela orsakssamband för en pedant heller. Det bevisar bara att viruset fanns i patientens prov. På samma sätt upptäcker ett positivt serologiresultat antikroppar mot viruset, vilket bara bevisar att det erkändes av en infekterad patients immunsystem vid någon tidpunkt. De typer av studier som behövs för att faktiskt bevisa orsakssamband är vanligtvis Långt ner i prioriteringslistan i en folkhälsohanteringsfas som vi befinner oss i när ett nytt virus dyker upp. Det bästa är (helt oetiskt) mänsklig infektion följt av infektion av andra primater och sedan flytta ner relevanslistan till andra furry critters som kan vara en lämplig stand-in för sjukdom hos människor.

PCR-reaktionsplatta.
foto av David från Flickr

det finns inget enkelt svar för att ta itu med problemet ovan. Mycket kretsar kring ord, pedanteri, riktlinjer, principer och kriterier. Ofta stöds dessa av många olika epidemiologiska studier som alla är starkt beroende av goda laboratorieresultat. Resultat som de som tillhandahålls av PCR. Som vi vet, håller Kochs postulat (förutom att applicera på bakterier och bara vara en guide) inte för bra i den molekylära världen av ny och framväxande virologi. Det finns dock modifieringar av postulaten.

andra samlingar som Bradford Hill-kriterierna får mer av körning idag. Man kan verkligen inte testa en influensa eller CoV som dödar 20-50% av de fall det finns i, med hjälp av mänskliga volontärer för att reproducera sjukdom och bevisa att agenten var ansvarig.

Jag har rullat ihop några funderingar om PCR: s roll och tillförlitlighet i en lista.

vad är PCR (snabbversionen)

PCR är en enzymdriven cyklisk koknings-och kylprocess som förstärker en fördefinierad DNA-sträcka med ett par lika fördefinierade och kommersiellt tillverkade oligonukleotider (korta DNA-sträckor) vi kallar primers (de Primar DNA-kopieringsprocessen som ligger till grund för amplifieringen). Lägg till ett omvänd transkriptionssteg i förväg och du kan använda PCR för att förstärka DNA från en fördefinierad RNA-Mall (Mall är det vi kopierar och förstärker).

sidnot #1 – virus kommer med DNA-eller RNA-genom. Ett positivt PCR-resultat bevisar inte aktiv replikering av ett virus. Det visar sig inte att infektiöst virus är närvarande. Det är därför vi föredrar att prata om att ett virus upptäcks hos patienter som använder PCR. Vissa hänvisar till ett PCR – positivt resultat som ett ”viralisolat” – gör det inte. detta bör reserveras för att beskriva eh framgångsrik tillväxt av ett virus med cell/vävnad/organkultur.

PCR fördubblar antalet bitar av mål-DNA (kopior eller amplicon-vilket betyder DNA-kopior av en enda art) varje cykel (1 cykel = uppvärmning och kylning). Ju mer DNA / RNA som du börjar med (vanligtvis motsvarar virusbelastningen) i ditt patientprov, desto tidigare får du tillräckligt med kopior för att mätas med hjälp av din detekteringsmetod (idag, mestadels fluorescenssignal). Jag har en sida på PCR-mekaniken här

med PCR, vi finner virus oftare

för sent, med användning av mycket känsliga PCR-metoder i respiratoriska virusundersökningar är vanliga, forskningsstudier har oftare upptäckt virus bland samplade personer utan tecken eller symtom på sjukdom…inte alltid omedelbart före eller efter om folket följs upp noggrant. Varför prova någon om de inte är sjuka? Bra fråga. Du kanske vill se om överföring sker även om en sjukdom inte gör det. Men tidigare, med hjälp av relativt okänsliga virusodlingsmetoder, skulle vi ha varit mindre benägna att upptäcka ett virus.

sidoanteckning #2 – Om vi vill förklara en sådan person ”asymptomatisk” – vi hade bättre vara helt säker på att de har absolut inga symptom på en infektion. Sjukdom, en avvikelse från normal kroppsfunktion, kan vara så mild som huvudvärk eller bara känna skurk – och fortfarande, pedantiskt, vara en sjukdom som tillskrivs viruset som detekteras av PCR. Låt oss anta att vårdnivån har tagits (ofta har den inte)

sidoanteckning #3 – vi går plattformar för virus, bakterier och svampar. Ta en titt på detta papper från Eric Delwart; i 2 barn-92% av 72 prover som samlats in varje vecka under mer än 250-dagar var viruspositiva (inga eller milda tecken på sjukdom som utvecklats under denna tid)! Det är mycket troligt, eftersom vi upptäcker mer olika agenter, bättre karakteriserar dem och utvecklar (och använder) förbättrade möjligheter, att vi kommer att lära oss att vi nästan aldrig är utan passagerare eller 3. Och ändå är vi inte alltid sjuka-varför är det?

immunitet kan hålla oss bra, även om de är smittade.

immunsystemet till undsättning! Vi har ett mycket skickligt, aktivt och multifunktionellt immunsystem. Det utmanas ständigt av … saker – inte bara virus, bakterier och svampar utan kemikalier, olika proteiner, kolhydrater, allergener, smuts och damm (består av bitar av allt annat) och det gör ett bra jobb att sortera igenom allt, svara på vad det behöver, för att förebygga sjukdom och vanligtvis krossa svaret på resten på ett sådant sätt att vi inte underpresterar 24/7 på grund av allergi och sjukdom. Det är på grund av detta komplexa system att vi inte bör bli förvånade över att eftersom tekniken låter oss hitta lägre nivåer av smittämnen är det helt rimligt att vara ”infekterad” men inte sjuk. Åtminstone i en del av våra möten med virus borde detta inte vara någon överraskning.

vi får mycket exponering för virus

Jag tycker att det är värt att lyfta fram att vi andas in upp till 60 liter luft per minut, med 0,1-7200 submikron partiklar (aerosolised; 0,3-0,5 occurm) per liter. I en studie, influensa RNA hittades oftare i partiklar 5 5 mgr än i de som är större än 5 mgr. Dessa små partiklar kan inandas och utandas ganska enkelt och vanligt. Detta belyser bara hur vanligt det förmodligen är för oss att andas in virus i våra luftvägar

provplats och överföring i asymptomatiska fall. Jag har inga data för detta men det verkar för mig att om du vattnar de övre luftvägarna har du vattnat den plats från vilken virus lätt hostas, nysas och därför överförs i större partiklar. Om ett virus upptäcks där verkar det finnas en god chans att överföring är möjlig. Händer det? Dessa studier är inte lätt synliga … eller kanske har de inte gjorts.

men föroreningen!

den stora grå jordnötsälskande amplicon i rummet är förorening. Det är amplicon från tidigare PCR-reaktioner som oavsiktligt kommer in i dina nya PCR-reagenser/pipetter/lab och ger oss ett positivt resultat när patienten faktiskt inte är infekterad. Det är vad vissa tänker på när en PCR-positiv inträffar hos en asymptomatisk person. Det är lätt att peka på detta som en anledning till ett obehagligt resultat. Men om labbet är expert på PCR, kommer de nödvändiga kontrollerna att vara på plats för att varna för kontaminering.

Plus, för vissa virus och i vissa laboratorier, används mer än en PCR-analys, som var och en riktar sig mot olika genetiska regioner och använder separata primers. Detta är fallet med det rekommenderade arbetsflödet för MERS-CoV-screening. Det betyder inte att dessa är de analyser som används naturligtvis. Och leta efter detaljer om testarbetsflödet som används är alltid användbart för att förstå sammanhanget för ett PCR-resultat.

andra användbara steg inkluderar separata laboratorier för Preparation av prov, beredning av reaktionsblandning och cykling; laboratorier med riktad luft – och arbetsflöden; disponibel allt; kommersiella reagenser; färdiga, målspecifika Kit (”analytes”); massor av negativa kontroller och så vidare. Dessa ger stort förtroende för ett PCR-resultat och är standard arbetspraxis för ett professionellt diagnostiskt PCR-laboratorium. Att ta mer än ett prov från ett misstänkt fall är också till hjälp.

PCR-laboratorier behöver rack. Färgglada rack säkerställer PCR-framgång!
foto från MadLab Manchester Digital Laboratory på Flickr.

det finns mycket expertis i PCR-världen

PCR har använts för att upptäcka virus sedan 1980-talet och det finns många mycket kunniga experter i användningen som vet hur man får tillförlitliga resultat och undviker kontaminering. Det finns också många publikationer som länkar infektiöst virus med ett PCR – resultat-PCR-positivitet har betydelse och litteraturen stöder det.

de av oss som har utfört PCR-experiment på mänskliga prover under många år kommer att veta att PCR inte är så praktiskt känsligt att det regelbundet kommer att upptäcka virus som bara sitter i näsan eftersom det inhalerades men inte replikerar. Utspädningsfaktorer se till att.

fortfarande händer problem och icke-professionella laboratorier finns. Det finns inget enkelt svar på frågorna från Prof Martin Haditsch på ProMED. Som med alla test handlar tillförlitlighet om att minska risken för fel i processen. Men även expertlaboratorier har dåliga dagar.

  1. MERS-COV-EASTERN MEDITERRANEAN (34): Saudiarabien, WHO http://www.promedmail.org/post/1788112
    sambandet mellan akut slapp myelit (AFM) och Enterovirus D68 (EV-D68) – vad är bevisen för orsakssamband?
    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29386095
  2. Enterovirus D68 och akut slapp myelit-utvärdering av bevis för orsakssamband
    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29482893

*importerat inlägg

  1. det här inlägget från 27JUN2013 publicerades på min gamla bloggplattform virologydownunder.blogspot.com.au. det har nu flyttats hit och lätt redigerats.

träffar: 9785

liknande lastning…

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.