omvandling av mRNA till dubbelsträngad cDNA

enzymatisk omvandling av mRNA till dubbelsträngad insats-DNA kan åstadkommas genom ett antal olika procedurer. Alla involverar verkan av omvänd transkriptas och oligonukleotidprimerad syntes av cDNA. Därefter avviker förfarandena i vanligt bruk avsevärt. Det finns ett antal metoder för att syntetisera den andra strängen och flera förfaranden för framställning av lämpliga ändar för framställning av klonbart DNA. De viktigaste målen för dessa förfaranden är att konstruera infoga DNA som är så länge som möjligt, med ett högt utbyte av omvandling av mRNA till DNA som kan ligera till vektor DNA. Följande protokoll kräver endast kommersiellt tillgängliga reagenser och är vanligtvis framgångsrika för att producera bra cDNA-bibliotek. Det grundläggande protokollet beskriver en metod för att göra trubbiga cDNA som sedan kan ligeras till länkar för efterföljande kloning till ett unikt restriktionsställe som EcoRI. Det alternativa protokollet är en variation som kräver färre enzymatiska manipuleringar och möjliggör konstruktion av riktnings-cDNA-bibliotek, vilket är särskilt önskvärt när målet är att generera uttrycks-cDNA-bibliotek. Det alternativa protokollet utnyttjar en linker-primer bestående av (i ordning från 3′ till 5′) en oligo(dT) primer, ett restriktionsställe för XhoI-endonukleas och en (GA)20-upprepning för att skydda restriktionsstället under generering av det trubbiga cDNA. De inre xhoi-platserna på de enskilda cDNA-molekylerna skyddas genom införlivande av 5-metyl-dCTP i den första strängnukleotidblandningen. De resulterande cDNA som har unika ändar kan klonas i EcoRI / XhoI-digererade vektorer efter ligering av EcoRI-adaptrar till 5′ – änden och matsmältningen av XhoI för att frigöra 3′ XhoI-platserna som införlivades i cDNA av länkprimeren. Dessa förändringar resulterar i ett väsentligt strömlinjeformat förfarande som är väsentligt snabbare och enklare än grundprotokollet.

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.