Ett tvåfärgat multiplexerat lateralt flöde immunoassay system för att differentiellt detektera humana malariaarter på en enda testlinje

princip för tvåfärgat LFA i den multiplexerade detekteringen av malariaantigener vid en enda testlinje av LFA-remsan

i LFA, när provvätskan dispenseras på en provkudde och flyter till konjugatet pad, de blå och röda latexpartiklarna fångar pldh respektive pfhrp2-antigener. Antigenerna bundna till latexpartiklarna transporteras därefter genom remsan och detekteras vid testlinjen där en blandning av detektionsantikroppar mot (pan)pLDH och PfHRP2 funktionaliseras (Fig. 1). Förändringen i färgprofilerna som utvecklats i testområdet motsvarar antalet fångade blå och röda latexpartiklar.

prestandan för LFA med två färger visades först genom att detektera rekombinanta malariaantigener som spikades i tvättbufferten vid olika koncentrationer. Tre olika diagnostiska scenarier testades: endast pLDH, endast PfHRP2 och samtidig pldh-PfHRP2-infektion. För samdetektering blandades pLDH och PfHRP2 i ett molförhållande av 1 till 6 för att efterlikna kliniska prover av P. falciparuminfektion . Femton minuter efter provdispensering följt av bufferttvätt registrerades färgprofilerna på testregionerna. När provet endast innehöll pLDH observerades blå testlinjer (Fig. 2a). Vid samtidig detektion visade testområdet en blandningsfärg av blått och rött (Fig. 2b). För endast pfhrp2-prover blev testlinjerna röda (Fig. 2c). Kontrolllinjerna på alla LFA-remsor visade en blandningsfärg av blått och rött, vilket indikerar att både röda och blå latexpartiklar transporterades genom remsorna.

Fig. 2
figure2

representativa testremsor av tvåfärgad LFA. Distinkta färger observerades vid testlinjerna, motsvarande en typ av antigener, såsom Blå testlinjer endast för pldh-detektion, B-blandningsfärg på testlinjer för samtidig detektion och c-röda testlinjer endast för pfhrp2-detektion. Blandningsfärgen vid kontrolllinjer indikerade att de röda och blå latexpartiklarna migrerade längs längden på remsan

egenskaper i färgprofiler för LFA-remsor

för att implementera den kvantitativa och kvalitativa metoden i analysen analyserades intensitetsprofilerna för LFA-remsorna. Bilderna på remsorna förvärvades med en 8-megapixel bakåtvänd kamera på en iPad Air 2 under samma vita LED-ljusförhållanden. Avståndet mellan testlinjen och kontrolllinjen var cirka 200 pixlar och bredden på linjen var cirka 50 pixlar i bilderna. För att få RGB-färgprofilerna öppnades bilderna med ImageJ-programvara och kördes ”Color Profiler” – kommandot. För enkelhetens skull analyserades endast de röda och blå intensitetsprofilerna, eftersom gröna intensitetsprofiler inte signifikant påverkade den röda och blå färgdiskrimineringen och gav ett hjälpvärde i färgbilder. Nitrocellulosmembranet i testremsan var vitt, vilket resulterade i höga bakgrundsintensiteter. Färgerna med kontrast på test-och kontrolllinjerna genererade topparna förfallna från bakgrundsintensiteterna (Fig. 3).

Fig. 3
figure3

röda och blå intensitetsprofiler för testremsor. RGB-färgprofiler erhölls från remsbilderna från Fig. 2. För enkelhet representerades röda och blå intensiteter, förutom den gröna intensiteten. a När blå färger dök upp på testlinjerna, röd intensitet var mer förfallen än blå intensitet. Denna trend berodde på att bakgrunden till den vita remsan behöll höga RGB-värden. b när blandningsfärg uppträdde vid testlinjerna genererades röda och blå toppar motsvarande koncentrationen av antigener. c för pfhrp2-detektering var de blå topparna mer förfallna än röda toppar, i omvänd observation från A

två spännande funktioner i färgprofilerna observerades. Först, när de blå testlinjerna dök upp på remsorna, var de röda intensitetstopparna mer förfallna än blå toppar i färgprofilerna. Detta beror på att den blå färgen behöll relativt högre blå pixelvärden än röda värden. Figur 3 visar de röda och blå intensitetsprofilerna för remsorna extraherade från bilder i Fig. 2. För pldh-detektering endast där starka blå testlinjer observerades, de röda intensiteterna var signifikant förfallna från toppbakgrundsintensiteter, mer än blå toppar (Fig. 3a). I samma sammanhang genererade pfhrp2-detektering med uppenbara röda testlinjer i bilderna de lägre blå topparna än röda toppar (Fig. 3c).

den andra funktionen i färgprofilerna var de icke-specifika färgtopparna i Fig. 3a (blå intensitet) och Fig. 3C (röd intensitet) som inte var associerade med färgutveckling av latexpartiklar. Icke-specifik bindning eller korsreaktivitet på testlinjerna observerades inte med blotta ögon. Verkligen, Fig. 2 visade tydlig skillnad i färger för varje detekteringsläge. Emellertid utvecklades de icke-specifika intensitetstopparna av bildkontrasten. När latexpartiklar ackumulerades vid testlinjerna ökade mörkret, vilket resulterade i minskande RGB-värden. Således toppar all intensitet i Fig. 3 var inte från de rena färgerna men påverkades av bildkontrast. Det var inte lätt att koppla bort kontrast och ren färg från bilder. En enkel korrelationsfunktion fastställdes emellertid genom att beräkna förhållandet mellan de röda och blå sönderfallsområdena för att diskriminera färgtypen. Detta togs upp och diskuteras i nästa avsnitt.

Detektionsgräns och gräns för färgskillnad

för att ytterligare analysera remsorna, undvika subjektivitet och bekräfta visuell detektionsgräns beräknades sönderfallsområden med röda och blå toppar från Fig. 3. För att beräkna toppområdena utfördes toppinriktningen först på bakgrundsintensiteten. Och sedan tillämpades Simpsons 3/8-regel på de inriktade topparna för den numeriska integrationen för att beräkna områden.

de resulterande graferna i Fig. 4 visade områdena med röda och blå toppar vid testlinjer som en funktion av antigenkoncentrationer från tre oberoende experiment. Både röda och blå sönderfallsområden ökade med ökande antigenkoncentrationer. Graden av sönderfallsområden beror dock på vilken typ av färger som utvecklats på testlinjerna. För endast pldh-prover var röda sönderfallsområden högre än blåa (Fig. 4a), medan PfHRP2 endast prover uppvisade motsatt trend (Fig. 4c). För att validera effekten av analysen uppskattades detektionsgränsen (LoD) genom att anta en standardmetod definierad som ett genomsnitt plus tre gånger standardavvikelsen (Snon-target + 3SD) för den tomma provsignalen. LoD vid vilken alla röda och blå signaler kunde särskiljas från de tomma provsignalerna uppskattades till 31,2 ng mL−1 i alla detekteringsscenarier (infogade figurer i Fig. 4).

Fig. 4
figure4

beräkning av röda och blå sönderfallsområden vid testlinjerna. De röda och blå sönderfallsområdena beräknades från Fig. 3 endast för pldh-detektering, B samtidig pldh-och PfHRP2-detektering och c PfHRP2-detektering. De olika graderna av sönderfallsområden mellan de röda och blå intensiteterna observerades som en funktion av Provtyper och koncentrationer. De infogade graferna zoomades in vid lägre koncentrationer. LoD att skilja från icke-målprover var 31,2 ng mL-1 för alla detekteringslägen. Felfält indikerar standardavvikelser från tredubbla experiment

därefter beräknades förhållandet mellan sönderfallsområden i rött till blått för att ge en enkel metod för färgdiskriminering (Fig. 5). Som förväntat ökade sönderfallsförhållandena med ökande pldh-koncentrationer som tillskrev röda färgintensiteter (toppkurva i Fig. 5). Regionen ovanför den övre blå kurvan är den enda pldh-regionen, vilket indikerar P. falciparum negativ.

Fig. 5
figure5

förhållanden mellan röda och blå sönderfallsområden. Den enkla funktionen för färgförhållandena beräknade från Fig. 4 tillhandahöll ett kriterium för att diskriminera färger som en funktion av provkoncentrationer. Den blå kurvan med cirkeltillverkare var ovanför de andra kurvorna, vilket indikerar starka blå färger. För den blå kurvan visades pldh-koncentrationer i x-axeln. Mittkurvan med diamantmarkörer var en mellanliggande kurva mellan topp-och bottenkurvor och representerade blandningsfärgerna rött och blått. För mittkurvan visades pfhrp2-koncentrationer i x-axeln och pldh/PfHRP2 blandades i förhållandet 1:6. Den nedre kurvan indikerade de starka röda färgerna. För den röda kurvan visades pfhrp2-koncentrationer i x-axeln. Pilarna i det infogade diagrammet visade gränsen för färgskillnad från vilken de blå färgerna kunde särskiljas från de röda färgerna. Felfält är standardavvikelser från tredubbla experiment

däremot minskade förhållandevärdena med ökande pfhrp2-koncentrationer (bottenkurva i Fig. 5). Regionen under den nedre röda kurvan innehåller endast PfHRP2. Eftersom pLDH är pan-specifikt bör det alltid vara närvarande för malariapositiva fall. För alla fyra mänskliga malariaarter kommer resultatet inte att falla i pfhrp2-regionen.

sönderfallsförhållandena i den samtidiga detekteringen var mellanliggande och inkluderade mellan toppkurvan och bottenkurvan i Fig. 5, vilket indikerar att det ska vara en blandningsfärg av blått och rött. Regionen mellan den övre blå kurvan och den nedre röda kurvan innehåller både pLDH och PfHRP2, vilket indikerar P. falciparum positivt.

gränsen för färgskillnad där de röda och blå färgerna kunde särskiljas med samma definition av LoD uppskattades. Det kan observeras att den övre kurvan i Fig. 5 var alltid högre än värdena plus 3SD i bottenkurvan efter 7,8 mg mL-1, satt som gränsen för färgskillnad (infogad figur i Fig. 5).

validering av tvåfärgad LFA genom att testa kliniska prover

För de 15 negativa proverna som testats ligger färgintensiteterna under LoD för både pLDH och PfHRP2 och betraktas därför som malariadnegativa. För att skilja infektionstyper och uppskatta antigenkoncentrationer för 10 malaria positiva prover, färgdiskriminering utfördes med RGB-värdena från ImageJ-analys. Eftersom pLDH är pan-specifikt och binder till alla malariaarter, kan närvaron av pLDH förväntas i alla malariapositiva prover. Pldh-koncentrationen kan uppskattas med dess motsvarande röda sönderfallsområden med kalibreringskurvan i Fig. 4. För alla malariapositiva prover antogs en fyrstegs test-och felmetod för att avgöra om provet är P. falciparum eller icke-P. falciparum (dvs. P. vivax, P. ovale eller P. malariae).

  • Steg 1: ImageJ används för att beräkna de röda och blå sönderfallsområdena för testlinjen, sedan beräknades förhållandet mellan röda och blå sönderfallsområden och definierades som ratio_cal.

  • steg 2: eftersom pLDH finns i alla positiva kliniska prover, antar att provet endast innehåller pLDH och korrelerar de röda sönderfallsområdena uppmätta i steg 1 med pldh-koncentrationer, med kalibreringskurvan i Fig. 4a.

  • steg 3: Hitta värdet på förhållandet mellan röda och blå sönderfallsområden (y-axeln) på den övre blå kurvan i Fig. 5 vid den beräknade pldh-koncentrationen (från Steg 2) och definiera den som ratio_ref.

  • steg 4: kommer att bestå av två scenarier: (1) Om ratio_cal Kazaki ratio_ref, faller provet i regionen ovanför den övre blå kurvan i Fig. 5 (pldh endast region), vilket indikerar icke-P. falciparum, men malaria positiv (P. vivax, P. ovale eller P. malariae). I detta scenario är de uppskattade pldh-koncentrationerna från Steg 2 giltiga eftersom proverna endast innehåller pLDH; (2) om ratio_cal < ratio_ref, faller provet i regionen mellan den övre blå kurvan och den nedre röda kurvan i Fig. 5 (pldh + pfhrp2-regionen), vilket indikerar P. falciparum positivt. I detta scenario, de uppskattade pldh-koncentrationerna från Steg 2 är inte giltiga eftersom proverna innehåller pLDH och PfHRP2, och kalibreringskurvan i Fig. 4a kan inte tillämpas. Tolkningen av blandningsfärg var komplicerad och eventuellt förspänd av bildkontrast. Det var inte heller lätt att skapa standardkurvor som kan täcka alla scenarier av färgkombinationer.

de röda och blå sönderfallsytorna och färgförhållandena för P. falciparum-positiva och P. vivax-positiva prover presenterades i tabellerna 1, 2.

Tabell 1 resultat av bildanalys och uppskattning av antigenkoncentrationer och typ av malariainfektion från Plasmodium falciparum positiva kliniska prover
tabell 2 resultat av bildanalys och uppskattning av antigenkoncentrationer och typ av malariainfektion från Plasmodium vivax kliniska prover

som visas i tabell 1 bekräftades de 5 proverna som P. falciparum-positiva genom mikroskopiundersökning. Med hjälp av fyrstegs trial and error-metoden som illustreras ovan uppskattades det röda till blå referensförhållandet (ratio_ref) till motsvarande röda sönderfallsområde med pldh-kalibreringskurvorna och jämfördes med det röda till blå förhållandet mellan kliniska prover (ratio_cal). Eftersom ratio_cal < ratio_ref för alla de 5 proverna som anges i Tabell 1, faller alla proverna i scenario två i steg 4 som beskrivits ovan. Då kan man dra slutsatsen att provet är P. falciparum positivt. Exempelvis bekräftas prov nr 25 som P. falciparum positivt genom mikroskopi. Det röda sönderfallsområdet och det blå sönderfallsområdet vid testlinjen är 917.11 respektive 499.20. Det röda till blå förhållandet mellan prov nr 25 (ratio_cal) är därför 1,84. Det röda till blå referensförhållandet vid motsvarande röda sönderfallsområde (917.11) (ratio_ref) beräknas med pldh-kalibreringskurvan i Fig. 4a, och värdet är 1,95. Sedan 1.95 (ratio_ref) > 1.84 (ratio_cal), bekräftas prov nr 25 som P. falciparum positivt av LFA-färgdiskriminering. Detta överensstämmer med både mikroskopi och ELISA-resultat.

som visas i Tabell 2 bekräftades de 5 proverna som P. vivax positiv genom mikroskopi undersökning. På liknande sätt erhölls ratio_ref och ratio_cal. Eftersom ratio_cal > ratio_ref för alla de 5 proverna som anges i Tabell 2 faller alla prover i pldh-regionen, vilket indikerar malaria positivt men negativt för P. falciparum. I detta fall, pldh kalibreringskurvan i Fig. 4a kan tillämpas för att få pldh-koncentrationerna för alla prover i Tabell 2. Exempelvis bekräftas prov nr 471 som P. vivax positivt genom mikroskopi. Det röda sönderfallsområdet och det blå sönderfallsområdet vid testlinjen är 631.10 respektive 299.22. Det röda till blå förhållandet mellan prov nr 471 (ratio_cal) är därför 2,11. Det röda till blå referensförhållandet vid motsvarande röda sönderfallsområde (631.10) (ratio_ref) beräknas med pldh-kalibreringskurvan i Fig. 4a, och värdet är 1,63. Sedan 2.11 (ratio_cal) > 1.63 (ratio_ ref), bekräftas prov nr 471 som malaria positivt men P. falciparum negativt av LFA-färgdiskriminering. Detta överensstämmer med både mikroskopi och ELISA-resultat.

För alla prover i Tabell 2 bör det noteras att pldh-kvantifieringsresultaten visade överensstämmelse mellan LFA-och ELISA-metoderna. Den uppskattade koncentrationen i LFA var lägre än för ELISA. Detta fel kan hänföras till skillnaden i standardkurvor för buffert och helblod kliniskt prov . Det bör också noteras för prov nr 486, pfhrp2-koncentrationer med LFA−och ELISA−metoder är 0 respektive 3,35 ng mL-1, eftersom 3,35 ng mL-1 redan ligger utanför LFA-lod för pfhrp2-detektion.

Lämna ett svar

Din e-postadress kommer inte publiceras.