Sekvence, Inverze Flip-PCR

Flip-PCR byla navržena tak, aby umožnila sled inverze malých regionů DNA v regulační oblasti s cílem zkoumat význam cis-působící prvky, na transkripční aktivitu (1). Flip-PCR, modifikace dva-krok překrývají prodloužení metodou site-specific mutageneze (2,3), vyžaduje dvě kola amplifikace s využitím dvou vnitřních inverze primerů a dvou wild-type vnější nebo doprovodná primery. Metoda je diagramována na obr. 1. Primery A A B jsou doprovodné primery a primery C A D jsou inverzní primery. První kolo zesílení, které Samostatně využívá sady jednoho doprovodného primeru (obr. 1A, B) a jeden inverzní primer (obr. 1C, D), vede k vytvoření dvou překrývajících se produktů. Vnitřní primery jsou navrženy tak, aby zahrnovaly oblast, která je komplementární k šabloně, stejně jako oblast obrácené sekvence. Dvě vnitřní primery (C a D) jsou komplementární v obrácené regionů a bude žíhání, rozšířit a být zesílen druhé kolo PCR pouze pomocí vnějších primerů (a a B). Výsledný produkt pak může být klonován přímo do klonovacího vektoru PCR nebo omezen v rámci externích primerů a klonován do vybraného vektoru. Produkty prvního kola zesílení slouží jako jediná šablona ve druhém kole. Proto nedochází ke kontaminujícímu zesílení šablony divokého typu, aby se snížila účinnost klonování.

Obr. 1.

schéma Flip-PCR procedury. Orientace sekvence inverze v šabloně divokého typu je na šabloně označena plnými černými šipkami. Oligonukleotidové primery jsou zobrazeny šipkami na jejich žíhacích místech podél šablony. Dva inverzní primery (C A D) se žíhají na protilehlé řetězce šablony DNA. Inverze část inverze primerů (C a D, je indikováno šrafované šipky) jsou komplementární k sobě navzájem, a ne žíhání wild-type šablony. Obsahují sekvenci šablon (černé šipky) obrácené (šrafované šipky). První kolo PCR zahrnuje dvě samostatné amplifikace pomocí A A C A B A D(Krok 1). Výrobky jsou odděleny od primerů a šablony čištěním gelu (Krok 2). Čištěné produkty se smísí, denaturují a nechávají se znovu vyčistit. Rozšíření rekombinací s zapuštěné 3′ koncích výsledky v celé délce inverze produkt, který je pak zesílen dále s vnější primery a a B (krok 3). Neshody v externích primerů vytvořit restrikční místa (R) v konečném produktu s cílem usnadnit subcloning.

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.