oxidarea rapidă a cisteinei la cistină în soluții apoase – implicații pentru analiza mediilor uzate

descărcați această notă (PDF)

oxidarea cisteinei în mediile de cultură celulară

mediile de cultură celulară furnizează de obicei toți aminoacizii necesari pentru creșterea celulelor. Limitările unuia sau mai multor aminoacizi nu numai că duc la creșterea suboptimă a culturilor celulare, dar au și un impact negativ asupra randamentului și calității produsului. În timpul dezvoltării procesului, analiza mediilor cheltuite ajută la monitorizarea concentrațiilor de aminoacizi și la determinarea ratelor de consum pentru a detecta și a evita astfel de limitări.acest lucru este deosebit de dificil în cazul cisteinei, deoarece se oxidează ușor pentru a forma cistină, un dimer de două molecule de cisteină, conectate printr-o punte disulfură. Recent, o lucrare dedicată temperaturii și stabilității stocării mediilor de cultură celulară a raportat, de asemenea, că aminoacidul cisteină este deosebit de instabil în condițiile testate (Krattenmacher și colab., 2018). Acest lucru este în conformitate cu experiența noastră, deoarece măsurăm adesea urme de cisteină sau numai, în timp ce cistina – forma sa oxidată – este detectată în mod clar. Am efectuat experimente care investighează comportamentul redox al cisteinei și cistinei în apă, ținând cont de faptul că condițiile mai complexe găsite în mediile de cultură celulară (uzate) ar putea facilita chimia mai complexă.

interconversia cisteinei în cistină în apă

pentru a afla mai multe despre stabilitatea cisteinei (în-)am pregătit o soluție de 1 mM în apă, am depozitat-o la temperatura camerei și am prelevat probe în diferite momente de timp. Am luat mai multe probe pe parcursul a 26 de ore și apoi o probă „pe termen lung” după 6 zile. Fiecare probă a fost derivată direct după eșantionare și măsurată folosind gradientul nostru de analiză a aminoacizilor brevetat pe un sistem Agilent 1290 UHPLC-DAD. O soluție de cistină de 0,5 mM a fost tratată în același mod și a servit drept control.

așa cum se vede în tabelul 1 și Figura 1, chiar și o probă dintr-o soluție de cisteină proaspăt preparată (0 h) conținea cantități detectabile de cistină. Deja 11% din aminoacid a fost inițial prezent sub formă de dimer. Această valoare a fost destul de stabilă pentru primele ore, posibil deoarece cisteina conținea deja o cistină înainte de solubilizare. După 24 de ore, mai multă cisteină s-a deplasat spre cistină, rezultând 65% cisteină și 35% cistină. După 6 zile, 98% din cisteină a fost transformată în cistină (Figura 2).spre deosebire de cisteină, cistina s-a dovedit a fi stabilă în soluție. Concentrația sa a rămas constantă și nu a putut fi detectată cisteină în niciuna dintre probele de control (vezi Tabelul 2, Figura 1+2).

în plus față de măsurătorile descrise mai sus, alicote ale soluțiilor de cisteină și cistină au fost tratate cu DTT (ditiotreitol) sau TCEP (tris(2-carboxietil)fosfină), doi agenți reducători comuni. Așa cum se arată în Tabelele 3 până la 6, ambii reactivi au protejat cisteina de oxidare la cistină și chiar au redus cistina la cisteină liberă aproape complet. Efectele de reducere ale TCEP au fost mai puternice comparativ cu TDT.

concluzie

cisteina este un constituent comun al mediilor de cultură celulară, dar adesea nu este detectată în probele de medii uzate, din cauza instabilității sale în soluții apoase. Experimentul descris în această notă arată că cisteina este oxidată în principal pentru a forma cistină. Oxidarea cisteinei la cistină implică, de asemenea, că cisteina și cistina nu trebuie incluse în același amestec standard. În schimb, standardele individuale de cisteină ar putea fi preparate și protejate de oxidare folosind TCEP.mai mult, am observat că oxidarea cisteinei se desfășoară și mai rapid în mediile de cultură celulară cu cisteină suplimentară (datele nu sunt prezentate). Acest lucru trebuie luat în considerare, atunci când potențialele limitări ale aminoacizilor sunt analizate prin analiza mediilor cheltuite. Prin urmare, este important să existe metode adecvate de cuantificare.

inclusiv cisteina și cistina, metoda noastră de analiză a aminoacizilor oferă rezultate cantitative pentru toți aminoacizii proteinogeni, precum și pentru etanolamină, citrulină, hidroxiprolină, ornitină și taurină. Contactați-ne pentru a solicita mai multe informații și testați-l.

analiza rapidă și fiabilă a aminoacizilor

tabele și figuri

Tab. 1

Tab. 1: sume Relative (rel. Amt.) de cisteină și cistină în cisteină proaspăt preparată de 1 mM în apă, măsurată prin UHPLC-DAD după derivatizare. Timpul de prelevare este afișat în ore / zile după preparare.

Tab. 2

Tab. 2: sume Relative (rel. Amt.) de cisteină și cistină în cistină proaspăt preparată de 0,5 mM în apă, măsurată prin UHPLC-DAD după derivatizare. Timpul de prelevare este afișat în ore / zile după preparare.

Tab. 3

Tab. 3: sume Relative (rel. Amt.) de cisteină și cistină în cisteină proaspăt preparată de 1 mM plus 0,5 mM DTT în apă, măsurată prin UHPLC-DAD după derivatizare. Timpul de prelevare este afișat în ore / zile după preparare.

Tab. 4

Tab.4: sume Relative (rel. Amt.) de cisteină și cistină în cisteină proaspăt preparată de 1 mM plus 0,5 mm TCEP în apă, măsurată prin UHPLC-DAD după derivatizare. Timpul de prelevare este afișat în ore / zile după preparare.

Tab. 5

Tab.5: sume Relative (rel. Amt.) de cisteină și cistină în cistină proaspăt preparată de 0,5 mM plus 0,5 mM DTT în apă, măsurată prin UHPLC-DAD după derivatizare. Timpul de prelevare este afișat în ore / zile după preparare.

Tab. 6

Tab.6: sume Relative (rel. Amt.) de cisteină și cistină în cistină proaspăt preparată de 0,5 mM plus 0,5 mm TCEP în apă, măsurată prin UHPLC-DAD după derivatizare. Timpul de prelevare este afișat în ore / zile după preparare.

Fig. 1

Fig. 1: Măsurători cisteină / cistină 0h după prepararea soluțiilor. Primul panou prezintă măsurători fără agent de reducere, al doilea panou reducerea TDT și al treilea panou reducerea TCEP. Sunt afișate cromatogramele UHPLC-DAD care se concentrează pe vârfurile de cisteină și cistină măsurate după derivatizare.

Fig. 2

Fig. 2: măsurători cisteină / cistină 6d după prepararea soluțiilor. Primul panou prezintă măsurători fără agent de reducere, al doilea panou reducerea TDT și al treilea panou reducerea TCEP. Sunt afișate cromatogramele UHPLC-DAD care se concentrează pe vârfurile de cisteină și cistină măsurate după derivatizare.

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.