Ce înseamnă un rezultat PCR pozitiv…sau nu înseamnă? – Virologie în meniul primar

reacția în lanț a polimerazei (PCR) a rămas un instrument de laborator extrem de important de zeci de ani. Modificări subtile ale enzimelor și modificări drastice ale detectării unui rezultat au avut loc în acel interval, dar instrumentul și fiabilitatea acestuia au rămas remarcabil de consistente.

post importat*

există întotdeauna comentarii precum cel de mai jos care se gândește în mod specific la găsirea materialului genetic MERS-CoV la persoanele asimptomatice sau ușor bolnave. Practic se întreabă de încrederea PCR.

în ceea ce privește cunoștințele mele, „infecția” este definită ca dovada unui agent infecțios și dovada multiplicării acestui agent în interiorul corpului (sau răspunsul inflamator asociat care poate fi legat de acest agent). Prin urmare, întrebarea mea este: unde a fost specimenul luat de la asistentele „asimptomatice”? PCR, după cum știm cu toții, detectează doar acizi nucleici. Deci, dacă multiplicarea nu poate fi dovedită și nu se dă un răspuns inflamator local sau sistemic, cum a fost exclusă „contaminarea” (indiferent dacă se datorează părților inactivate ale MERS-CoV sau chiar particulelor virale complete)? Aceasta nu este doar o întrebare semantică, ci ar trebui să aibă un impact asupra numărului raportat de „cazuri”.

Martin Haditsch scriind în ProMED

sentimentul pe care îl am de la acestea este că unii nu au încredere în rezultatele PCR sau poate în rezultatele obținute. Rezultatele PCR singure nu îndeplinesc nevoia de a vedea virusul Replicant într-o gazdă înainte de a atribui orice fel de rol cauzal acelui virus. Dar acest lucru este adesea impracticabil și frecvent inutil, deoarece un rezultat PCR pozitiv este, în general, un proxy fiabil pentru prezența infecției cu virus activ.

cultivarea unui izolat nu ar atribui cauzalitate nici unui pedant. Doar dovedește că virusul era în mostra pacientului. În mod similar, un rezultat serologic pozitiv detectează anticorpi împotriva virusului, dovedind doar că a fost recunoscut de sistemul imunitar al unui pacient infectat la un moment dat. Tipurile de studii necesare pentru a dovedi cauzalitatea sunt, de obicei, pe lista priorităților într-o fază de management al sănătății publice, cum ar fi atunci când apare un nou virus. Cea mai bună ființă (complet lipsită de etică) infecție umană urmată de infecția altor primate și apoi, trecând pe lista de relevanță, la alte creaturi cu blană care pot fi un stand-in adecvat pentru boala la om.

placă de reacție PCR.
fotografie de David de la Flickr

nu există un răspuns ușor pentru a aborda problema de mai sus. O mulțime se învârte în jurul cuvintelor, pedantriei, orientărilor, principiilor și criteriilor. Adesea, acestea sunt susținute de o mulțime de studii epidemiologice diferite, care se bazează foarte mult pe rezultate bune de laborator. Rezultate precum cele furnizate de PCR. După cum știm, postulatele lui Koch (în afară de aplicarea la bacterii și de a fi doar un ghid) nu rezistă prea bine în lumea moleculară a virologiei noi și emergente. Există totuși modificări ale postulatelor.

alte colecții, cum ar fi criteriile Bradford Hill, se desfășoară mai mult în aceste zile. Cu siguranță nu se poate testa o gripă sau CoV care ucide 20-50% din cazurile în care se găsește, folosind voluntari umani pentru a reproduce boala și a dovedi că agentul a fost responsabil.

am adunat câteva meditații despre rolul și fiabilitatea PCR într-o listă.

ce este PCR (versiunea rapidă)

PCR este un proces ciclic de gătit și răcire condus de enzime care amplifică o porțiune predefinită de ADN folosind o pereche de oligonucleotide la fel de predefinite și fabricate comercial (întinderi scurte de ADN) pe care le numim primeri (ei primează procesul de copiere a ADN-ului care stă la baza amplificării). Adăugați în prealabil un pas de transcriere inversă și puteți utiliza PCR pentru a amplifica ADN-ul realizat dintr-un șablon ARN predefinit (șablonul fiind lucrul pe care îl copiem și amplificăm).

nota laterală #1 – virușii vin cu genomi ADN sau ARN. Un rezultat PCR pozitiv nu dovedește replicarea activă a unui virus. Nu dovedește că virusul infecțios este prezent. Acesta este motivul pentru care preferăm să vorbim despre detectarea unui virus la pacienții care utilizează PCR. Unii se referă la un rezultat pozitiv PCR ca un „izolat viral” – Nu. Acest lucru ar trebui rezervat pentru a descrie creșterea cu succes a unui virus folosind cultura de celule/țesuturi/organe.

PCR dublează numărul de bucăți de ADN țintă (copii sau amplicon-adică copii ADN ale unei singure specii) în fiecare ciclu (1 ciclu = rundă de încălzire și răcire). Cu cât începeți mai mult ADN/ARN (de obicei echivalează cu încărcătura virală) în eșantionul pacientului, cu atât mai repede veți obține suficiente copii pentru a fi măsurate folosind metoda de detectare la alegere (astăzi, mai ales semnal de fluorescență). Am o pagină despre mecanica PCR aici

cu PCR, găsim virusul mai des

târziu, cu utilizarea unor metode PCR foarte sensibile în investigațiile virusului respirator fiind un lucru obișnuit, studiile de cercetare au detectat mai des virusul în rândul persoanelor eșantionate fără semne sau simptome de boală…de asemenea, nu întotdeauna imediat înainte sau după dacă oamenii sunt urmăriți cu atenție. De ce să probezi pe cineva dacă nu este bolnav? Bună întrebare. Poate doriți să vedeți dacă transmiterea are loc chiar dacă o boală nu. Dar, în trecut, folosind metode de cultură a virusului relativ insensibile, am fi fost mai puțin susceptibili să detectăm un virus.

Nota laterală #2 – dacă dorim să declarăm o astfel de persoană „asimptomatică” – ar fi bine să fim complet siguri că nu au absolut niciun simptom al unei infecții. Boala, o abatere de la funcția normală a corpului, poate fi la fel de ușoară ca o durere de cap sau doar senzație de escroc – și totuși, pedantic, să fie o boală atribuită virusului detectat prin PCR. Să presupunem că nivelul de îngrijire a fost luat (de multe ori nu a fost)

nota laterală #3 – suntem platforme de mers pe jos pentru viruși, bacterii și ciuperci. Uitați-vă la această lucrare de la Eric Delwart; la 2 copii-92% din 72 de probe colectate săptămânal pe parcursul a mai mult de 250 de zile au fost pozitive la virus (nu s-au dezvoltat semne ușoare de boală în acest timp)! Este foarte probabil, pe măsură ce descoperim agenți mai diversi, îi caracterizăm mai bine și dezvoltăm (și folosim) capacități îmbunătățite, că vom învăța că nu suntem niciodată fără pasager sau 3. Și totuși nu suntem întotdeauna bolnavi-de ce este asta?

imunitatea ne poate menține bine, chiar dacă este infectată.

sistemul imunitar la salvare! Avem un sistem imunitar foarte capabil, activ și multifuncțional. Este în mod constant provocată de…lucruri – nu doar viruși, bacterii și ciuperci, ci substanțe chimice, diverse proteine, carbohidrați, alergeni, murdărie și praf (compuse din bucăți din toate celelalte lucruri) și face o treabă excelentă de a sorta prin toate, răspunzând la ceea ce are nevoie, pentru a preveni bolile și, de obicei, zdrobind răspunsul la restul în așa fel încât să nu ne sub-Performăm 24/7 din cauza alergiilor și a bolilor. Datorită acestui sistem complex nu ar trebui să fim surprinși că, deoarece tehnologia ne permite să găsim niveluri mai scăzute de agenți infecțioși, este complet rezonabil să fim „infectați”, dar nu bolnavi. Cel puțin într-o anumită proporție din întâlnirile noastre cu viruși, acest lucru nu ar trebui să fie o surpriză.

avem foarte multă expunere la virus

cred că merită subliniat faptul că respirăm până la 60 de litri de aer pe minut, cu 0,1-7200 particule submicronice (aerosolizate; 0,3-0,5 centimetri) pe litru. Într-un studiu, ARN-ul gripal A fost găsit mai des în particule de 5-5-x-x-x-x decât în cele mai mari de 5-x-x-x-x. Aceste particule mici pot fi inhalate și expirate destul de ușor și frecvent. Acest lucru evidențiază doar cât de obișnuit este probabil să inhalăm viruși în căile respiratorii

site-ul eșantionului și transmiterea în cazuri asimptomatice. Nu am date pentru acest lucru, dar mi se pare că, dacă tamponați căile respiratorii superioare, ați tamponat site-ul din care virusul este ușor tuse, strănut și, prin urmare, transmis în particule mai mari. Dacă un virus este detectat acolo, atunci s-ar părea că există șanse mari de transmitere. Se întâmplă? Aceste studii nu sunt ușor vizibile … sau poate că nu au fost făcute.

dar contaminarea!

marele amplicon iubitor de arahide gri din cameră este contaminarea. Acesta este amplicon din reacțiile PCR anterioare care intră accidental în noii reactivi PCR/pipete/laborator și ne oferă un rezultat pozitiv atunci când pacientul nu este de fapt infectat. La asta se gândesc unii când apare un PCR pozitiv la o persoană asimptomatică. Este ușor să indicați acest lucru ca un motiv pentru un rezultat dezagreabil. Cu toate acestea, în cazul în care laboratorul este un expert în PCR, atunci controalele necesare vor fi în loc pentru a da avertizare de contaminare.

în plus, pentru unele virusuri și în unele laboratoare, sunt utilizate mai multe teste PCR, fiecare vizând diferite regiuni genetice și folosind primeri separați. Acesta este cazul fluxului de lucru recomandat pentru screening-ul MERS-CoV. Aceasta nu înseamnă că acestea sunt testele utilizate desigur. Și căutați detalii despre fluxul de lucru de testare utilizat este întotdeauna util pentru a înțelege contextul unui rezultat PCR.

alte etape utile includ laboratoare separate pentru pregătirea probelor, pregătirea amestecului de reacție și ciclismul; laboratoare cu fluxuri direcționale de aer și de lucru; totul de unică folosință; reactivi comerciali; kituri pre – fabricate, specifice țintei („analiți”); o mulțime de controale negative și așa mai departe. Acestea oferă încredere considerabilă într-un rezultat PCR și sunt o practică de lucru standard pentru un laborator PCR de diagnostic profesional. Luarea mai multor probe dintr-un caz suspectat este, de asemenea, utilă.

laboratoarele PCR au nevoie de rafturi. Rafturile colorate asigură succesul PCR!
fotografie de la Laboratorul Digital MadLab Manchester pe Flickr.

există o mulțime de expertiză în lumea PCR

PCR a fost folosit pentru a detecta viruși încă din anii 1980 și există mulți experți foarte cunoscuți în utilizarea sa care știu cum să obțină rezultate fiabile și să evite contaminarea. Există, de asemenea, multe publicații care leagă virusul infecțios cu un rezultat PCR – pozitivitatea PCR are sens și literatura de specialitate susține acest lucru.

aceia dintre noi care au efectuat experimente PCR pe probe umane de-a lungul multor ani vor ști, PCR nu este atât de practic sensibil încât va detecta în mod regulat virusul care stă doar în nas pentru că a fost inhalat, dar nu se reproduce. Factorii de diluare se ocupă de asta.

totuși, se întâmplă probleme și există laboratoare neprofesionale. Nu există un răspuns ușor la întrebările adresate de profesorul Martin Haditsch pe ProMED. Ca și în cazul oricărui test, fiabilitatea se referă la reducerea riscului de defecțiuni în acest proces. Dar chiar și laboratoarele de experți au zile proaste.

  1. MERS-COV – Mediterana de Est (34): ARABIA Saudită, care http://www.promedmail.org/post/1788112
    asocierea dintre mielita acută flască (AFM) și enterovirusul D68 (EV-D68) – care sunt dovezile cauzalității?
    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29386095
  2. Enterovirus D68 și mielită flască acută-evaluarea dovezilor de cauzalitate
    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29482893

*Post importat

  1. acest post de la 27JUN2013 a fost postat pe vechea mea platformă de blog virologydownunder.blogspot.com.au. acum a fost mutat aici și ușor editat.

Hits: 9785

cum ar fi încărcarea…

Lasă un răspuns

Adresa ta de email nu va fi publicată.