Rápida Oxidação da Cisteína para Cistina em Soluções Aquosas – Implicações para o Gasto Análise de Mídia

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Cisteína oxidação em meio de cultura celular

Célula meios de cultura tipicamente fornecem todos os aminoácidos necessários para as células a crescer. As limitações em um ou mais aminoácidos não só resultam no crescimento suboptimal das culturas celulares, mas também têm um impacto negativo no rendimento do produto e na qualidade. Durante o desenvolvimento do processo, a análise de meios usados ajuda a monitorar as concentrações de aminoácidos e determinar as taxas de consumo, a fim de detectar e evitar tais limitações.

isto é particularmente desafiador no caso da cisteína, uma vez que ela fica facilmente oxidada para formar cistina, um dímero de duas moléculas de cisteína, conectada através de uma ponte dissulfeto. Recentemente, um artigo dedicado à estabilidade de temperatura e armazenamento dos meios de cultura de células também relatou que a cisteína aminoácida é particularmente instável sob as condições testadas (Krattenmacher et al., 2018). Isto está de acordo com a nossa experiência, pois muitas vezes medimos não ou apenas vestígios de cisteína, enquanto a cistina – a sua forma oxidada – é claramente detectada. Nós realizamos experimentos investigando o comportamento redox de cisteína e cistina na água, tendo em mente que as condições mais complexas encontradas nos meios de cultura celular (gastos), podem facilitar uma química mais complexa.

interconversão da cisteína para a cistina em água

a fim de aprender mais sobre a estabilidade da cisteína (in-)preparámos uma solução de 1 mM em água, armazenámo-la à temperatura ambiente e recolhemos amostras em diferentes pontos temporais. Recolhemos várias amostras ao longo de 26 horas e depois uma amostra “a longo prazo” ao fim de 6 dias. Cada amostra foi derivada diretamente após a amostragem e medida usando nosso gradiente de análise de aminoácidos Proprietário em um sistema Agilent 1290 UHPLC-DAD. Uma solução de 0, 5 mM de cistina foi tratada da mesma forma e serviu como um controle.

tal como se vê na Tabela 1 e na Figura 1, mesmo uma amostra de uma solução de cisteína preparada recentemente (0 h) continha quantidades detectáveis de cistina. Já 11% do aminoácido estava inicialmente presente na forma do dímero. Este valor foi bastante estável para as primeiras horas, possivelmente porque a cisteína já continha alguma cistina antes da solubilização. Após 24 h, Mais cisteína tinha mudado para cistina resultando em 65% cisteína e 35% cistina. Após 6 dias, 98% da cisteína foi transformada em cistina (Figura 2).

em contraste com a cisteína, a cistina demonstrou ser estável na solução. A sua concentração manteve-se constante e não foi detectada cisteína em nenhuma das amostras de controlo (ver Quadro 2, Figura 1+2).

além das medições acima descritas, alíquotas das soluções de cisteína e cistina foram tratadas com ITT (ditiotreitol) ou TCEP (tris(2-carboxietil)fosfina), dois agentes redutores comuns. Como mostrado nas tabelas 3 a 6, ambos os reagentes protegeram a cisteína da oxidação à cistina, e até mesmo reduziram a cistina à cisteína livre quase completamente. Os efeitos de redução da TCEP foram mais fortes do que a TTT.

conclusão

cisteína é um componente comum dos meios de cultura celular, mas muitas vezes não é detectado em amostras de meios usados, devido à sua instabilidade em soluções aquosas. O experimento descrito nesta nota mostra que a cisteína é oxidada principalmente para formar cistina. A oxidação da cisteína à cistina implica também que a cisteína e a cistina não devem ser incluídas na mesma mistura padrão. Em vez disso, os padrões individuais de cisteína poderiam ser preparados e protegidos da oxidação usando TCEP.

além disso, observamos a oxidação da cisteína para avançar ainda mais rápido em meios de cultura celular enriquecido com cisteína adicional (dados não mostrados). Isto tem que ser considerado, quando as limitações potenciais de aminoácidos estão sendo analisadas pela análise de meios usados. Por conseguinte, é importante dispor de métodos de quantificação adequados.

incluindo cisteína e cistina, o nosso método de análise de aminoácidos fornece resultados quantitativos para todos os aminoácidos proteinogénicos, bem como para etanolamina, citrulina, hidroxiprolina, ornitina e taurina. Entre em contato conosco para solicitar mais informações e testá-las.

análise rápida e confiável de aminoácidos

tabelas e figuras

Tab. 1

Tab. 1: montantes relativos (rel. Amt.) de cisteína e cistina em cisteína de 1 mM recentemente preparada em água, medida por UHPLC-DAD após derivatização. O tempo de amostragem é apresentado em horas / dias após a preparação.

Tab. 2

Tab. 2: montantes relativos (rel. Amt.) de cisteína e cistina em cistina em água acabada de preparar 0,5 mM, medida por UHPLC-DAD após derivatização. O tempo de amostragem é apresentado em horas / dias após a preparação.

Tab. 3

Tab. 3: montantes relativos (rel. Amt.) de cisteína e cistina em cisteína de 1 mM de preparação recente Mais 0,5 mM de TDT em água, medidos por UHPLC-DAD após derivatização. O tempo de amostragem é apresentado em horas / dias após a preparação.

Tab. 4

Tab.4: montantes relativos (rel. Amt.) de cisteína e cistina em cisteína de 1 mM de preparação recente Mais 0,5 mm de TCEP em água, medidos por UHPLC-DAD após derivatização. O tempo de amostragem é apresentado em horas / dias após a preparação.

Tab. 5

Tab.5: montantes relativos (rel. Amt.) de cisteína e cistina em cistina recém-preparada com 0, 5 mM de cistina mais 0, 5 mM de TDT em água, medidos por UHPLC-DAD após derivatização. O tempo de amostragem é apresentado em horas / dias após a preparação.

Tab.6: montantes relativos (rel. Amt.) de cisteína e cistina em cistina recém-preparada com 0, 5 mM de cistina mais 0, 5 mM de TCEP em água, medidos por UHPLC-DAD após derivatização. O tempo de amostragem é apresentado em horas / dias após a preparação.

Fig. 1

Fig. 1: Medição da cisteína/cistina 0h após preparação das soluções. O primeiro painel mostra medições sem agente redutor, o segundo painel de redução do TTT e o terceiro painel de redução do TCEP. Exibidos são cromatogramas UHPLC-DAD com foco nos picos de cisteína e cistina medidos após derivação.

Fig. 2

Fig. 2: medições da cisteína / cistina 6d após preparação das soluções. O primeiro painel mostra medições sem agente redutor, o segundo painel de redução do TTT e o terceiro painel de redução do TCEP. Exibidos são cromatogramas UHPLC-DAD com foco nos picos de cisteína e cistina medidos após derivação.

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