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the polymerase chain reaction (PCR) has remained a hugely important laboratory tool for decades. Mudanças sutis nas enzimas e mudanças drásticas na detecção de um resultado ocorreram nesse período, mas a ferramenta e sua confiabilidade permaneceram notavelmente consistentes.

IMPORTADO POST*

Há sempre comentários como o abaixo que especificamente musas sobre a descoberta de MERS-CoV material genético em assintomáticos ou levemente pessoas doentes. Eles basicamente se perguntam sobre a confiabilidade da PCR.

quanto ao meu conhecimento, “infecção” é definida como a prova de um agente infeccioso e a prova de multiplicação deste agente no interior do corpo (ou resposta inflamatória associada que pode estar ligada a este agente). Portanto, a minha pergunta é: onde foi o espécime retirado das enfermeiras” assintomáticas”? A PCR, como todos sabemos, apenas detecta ácidos nucleicos. Então, se a multiplicação não pode ser provada e não é dada nenhuma resposta inflamatória local ou sistémica, como foi excluída a” contaminação ” (não importa se devido a partes inativadas de MERS-CoV ou mesmo partículas virais completas)? Esta não é apenas uma questão semântica, mas deve impactar o número relatado de “casos”.

Prof Martin Haditsch escrevendo em ProMED

a sensação que eu tenho a partir destes é que alguns não confiam nos resultados da PCR ou talvez os resultados-getters. Os resultados da PCR por si só não satisfazem a necessidade de ver vírus replicantes num hospedeiro antes de atribuir qualquer tipo de papel causal a esse vírus. Mas isso é muitas vezes impraticável e frequentemente desnecessário porque um resultado positivo de PCR é geralmente um proxy confiável para a presença de infecção por vírus ativo.a cultura de um isolado também não atribuiria causalidade a um pedante. Só prova que o vírus estava na amostra do paciente. Da mesma forma, um resultado serológico positivo detecta anticorpos ao vírus, provando apenas que foi reconhecido pelo sistema imunológico de um paciente infectado em algum momento. Os tipos de estudos necessários para provar efectivamente a causalidade encontram-se geralmente bem abaixo da lista de prioridades numa fase de gestão da saúde pública, como é o caso quando surge um novo vírus. O melhor ser humano (completamente antiético) infecção seguida por infecção de outros primatas e, em seguida, movendo-se para baixo a lista de relevância, para outras criaturas peludas que podem ser um stand-in Adequado para a doença em seres humanos.

PCR reaction plate.
Photo by David from Flickr

There is no easy answer to address the issue above. Muita coisa gira em torno de palavras, pedantismo, diretrizes, princípios e critérios. Muitas vezes, estes são apoiados por muitos estudos epidemiológicos diferentes que dependem fortemente de bons resultados laboratoriais. Resultados como os fornecidos pela PCR. Como sabemos, os postulados de Koch (além de se aplicar a bactérias e ser apenas um guia) não se sustentam muito bem no mundo molecular da virologia nova e emergente. No entanto, há modificações dos postulados.

outras coleções como os critérios de Bradford Hill têm mais de execução nos dias de hoje. Certamente não se pode testar uma gripe ou CoV que mata 20-50% dos casos encontrados, usando voluntários humanos para reproduzir doenças e provar que o agente foi o responsável.

reuni algumas reflexões sobre o papel e confiabilidade da PCR em uma lista.

o Que é a PCR (a versão rápida)

PCR é uma enzima orientado e cíclico de cozimento e resfriamento de processo que amplifica uma pré-definidos trecho de DNA usando um par de igualmente pré-definidos e comercialmente feito oligonucleotídeos (curtos trechos de DNA) chamamos de primers (eles primeiro-o DNA de cópia de processo que sustenta a amplificação). Adicione um passo de transcrição reversa de antemão e você pode usar PCR para amplificar o DNA feito a partir de um modelo de RNA pré-definido (modelo sendo a coisa que estamos copiando e amplificando).

nota lateral #1 – Os vírus vêm com genomas de ADN ou ARN. Um resultado positivo da PCR não prova a replicação activa de um vírus. Não prova a presença de vírus infecciosos. É por isso que preferimos falar sobre um vírus sendo detectado em pacientes usando PCR. Alguns referem – se a um resultado positivo da PCR como um “isolado viral” – não. isto deve ser reservado para descrever o crescimento bem sucedido de um vírus usando cultura de células/tecidos/órgãos.

PCR duplica o número de peças de ADN alvo (cópias ou cópias de ADN de uma única espécie) a cada ciclo (1 ciclo = Ciclo de aquecimento e arrefecimento). Quanto mais DNA/RNA você começar com (normalmente equivale à carga viral) em sua amostra de paciente, mais cedo você obter cópias suficientes para ser medido usando o seu método de detecção de escolha (hoje, principalmente sinal de fluorescência). Eu tenho uma página sobre a mecânica de PCR aqui

Com PCR, encontramos vírus mais frequentemente

De tarde, com o uso de muito sensível PCR métodos de vírus respiratório investigações, sendo comuns as pesquisas mais frequentemente detectados vírus entre os amostrados pessoas, sem sinais ou sintomas da doença…também nem sempre imediatamente antes ou depois, se as pessoas são seguidas cuidadosamente. Porquê provar alguém se não está doente? Boa pergunta. Você pode querer ver se a transmissão ocorre mesmo se uma doença não ocorre. Mas no passado, usando métodos de cultura de vírus relativamente insensíveis, teríamos menos probabilidade de detectar um vírus.

Lado nota #2 – se nós estamos olhando para declarar tal pessoa “assintomáticos” – é melhor ter a certeza absoluta de que eles não têm absolutamente nenhum sintomas de uma infecção. A doença, um desvio da função normal do corpo, pode ser tão leve como uma dor de cabeça ou apenas sentir – se trapaceiro-e ainda, pedanticamente, ser uma doença atribuída ao vírus detectado pela PCR. Vamos supor que o nível de cuidado foi tomado (muitas vezes não tem)

nota #3 – estamos a caminhar de plataformas para vírus, bactérias e fungos. Dê uma olhada neste artigo de Eric Delwart; em 2 crianças-92% das 72 amostras coletadas semanalmente durante mais de 250 dias foram vírus-positivos (não ou sinais leves de doença desenvolvidos durante este tempo)! É muito provável, à medida que descobrimos agentes mais diversos, melhor caracterizá-los e desenvolver (e usar) capacidades melhoradas, que vamos aprender que quase nunca estamos sem um passageiro ou 3. No entanto, nem sempre estamos doentes – porquê?

imunidade pode manter-nos bem, mesmo se infectados.o sistema imunitário salva! Temos um sistema imunitário muito capaz, activo e multifuncional. Ele está constantemente sendo desafiado por…coisas – e não apenas o vírus, bactérias e fungos, mas os produtos químicos, várias proteínas, hidratos de carbono, alérgenos, poeira e sujeira (composta de pedaços de todos que outras coisas) e ele faz um grande trabalho de classificação, através de tudo isso, respondendo ao que ele precisa, para prevenir a doença, e geralmente esmagar a resposta para o resto de tal maneira que nós não sob a realizar 24/7 por causa de alergia e doenças. É devido a este sistema complexo que não devemos nos surpreender que como a tecnologia nos permite encontrar níveis mais baixos de agentes infecciosos, é completamente razoável ser “infectado”, mas não doente. Pelo menos em alguma proporção de nossos encontros com vírus, isso não deve ser surpresa. acho que vale a pena salientar que respiramos até 60 litros de ar por minuto, com partículas submicron 0, 1-7200 (aerossolizadas; 0, 3-0, 5 µm) por litro. Num estudo, o ARN da gripe foi encontrado mais frequentemente em partículas ≤5µM do que nas maiores de 5µM. Estas pequenas partículas podem ser inaladas e exaladas com bastante facilidade e frequência. Isso apenas destaca como é comum para nós inalar vírus em nosso site de amostra vias aéreas

e transmissão em casos assintomáticos. Não tenho dados para isto, mas parece-me que se esfregarem as vias aéreas superiores, limparam o local do qual o vírus é facilmente tossido, espirrado e, portanto, transmitido em partículas maiores. Se um vírus for detectado lá, então parece haver uma boa chance de transmissão ser possível. Acontece? Esses estudos não são facilmente visíveis … ou talvez não tenham sido feitos.mas a contaminação! o grande fragmento cinzento que adora amendoins na sala é a contaminação. Isto é amplicon de reações anteriores PCR que acidentalmente entra em seus novos reagentes PCR / pipetas / laboratório e nos dá um resultado positivo quando o paciente não está realmente infectado. É o que alguns pensam quando um PCR positivo ocorre em uma pessoa assintomática. É fácil apontar isto como uma razão para um resultado desagradável. No entanto, se o laboratório for um especialista em PCR, então os controles necessários estarão em vigor para dar aviso de contaminação.

Mais, para alguns vírus e em alguns laboratórios, são utilizados mais de um teste PCR, cada um visando diferentes regiões genéticas e usando primers separados. Este é o caso do fluxo de trabalho recomendado para o rastreio de Sers-CoV. Não significa que estes sejam os ensaios utilizados, é claro. E procure detalhes sobre o fluxo de trabalho de teste usado é sempre útil para entender o contexto de um resultado PCR.

outras etapas úteis incluem laboratórios separados para preparação de amostras, preparação de mistura de reação e ciclismo; laboratórios com fluxos de ar e trabalho direcionais; tudo descartável; reagentes comerciais; kits pré – feitos, específicos do alvo (“analitos”); lotes de controles negativos e assim por diante. Estes oferecem uma confiança considerável em um resultado PCR e são práticas de trabalho padrão para um laboratório de diagnóstico profissional PCR. Tomar mais de uma amostra de um caso suspeito também é útil.

PCR laboratórios necessidade de racks. Racks coloridos garantem o sucesso da PCR!
Foto de MadLab Manchester Digital Laboratory no Flickr.

, Há um monte de experiência na PCR mundo

PCR tem sido utilizada para detectar a presença de vírus desde a década de 1980 e há muitos especialistas experientes na sua utilização, que sabem como obter resultados confiáveis e evitar a contaminação. Há também muitas publicações que ligam o vírus infeccioso com um resultado da PCR – a positividade da PCR tem significado e a literatura apoia isso.

aqueles de nós que realizaram experimentos PCR em amostras humanas ao longo de muitos anos saberão, PCR não é tão praticamente sensível que irá detectar regularmente vírus que está apenas sentado em seu nariz porque ele foi inalado, mas não está replicando. Os factores de diluição garantem isso.ainda assim, problemas acontecem e laboratórios não profissionais existem. Não existe uma resposta fácil às perguntas colocadas pelo Prof. Martin Haditsch sobre o ProMED. Como em qualquer teste, confiabilidade é sobre a redução do risco de falhas no processo. Mas até os laboratórios especializados têm dias maus.

  1. MERS-COV – Eastern MEDITERRANEAN (34): SAUDI ARABIA, WHOhttp://www.promedmail.org/post/1788112
    The association between acute flaccid myelitis (AFM) and Enterovirus D68 (EV-D68) – what is the evidence for causation?
    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29386095
  2. Enterovirus D68 e flácida aguda mielite-avaliar as evidências de causalidade
    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29482893

*Importado Post

  1. Este post do 27JUN2013 foi publicado no meu antigo blog-plataforma virologydownunder.blogspot.com.ua. Agora foi movido para aqui e levemente editado.

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