Wprowadzenie Do Fiksacji Dla Histologii: Pomyśl Zanim Naprawisz!

w przypadku wielu eksperymentów komórkowych lub tkankowych mikroskopia histologiczna może być punktem końcowym, a w tej serii artykułów chcemy zilustrować, w jaki sposób połączone myślenie dotyczące pobierania tkanek lub komórek, utrwalania i przetwarzania, późniejszego barwienia, obrazowania mikroskopowego i analizy przyniesie lepsze wyniki.

ułatwiają obrazowanie

na przykład intensywne dobrze zabarwione komórki fluorescencyjne lub tkanki znacznie ułatwią obrazowanie, niezależnie od tego, czy używasz mikroskopii widefield, konfokalnej czy superrozdzielczej. Dobre barwienie zostanie osiągnięte poprzez zastosowanie odpowiednich systemów wykrywania i odpowiednio utrwalonych komórek lub tkanek.

celem utrwalania

celem utrwalania jest zachowanie komórek lub tkanek w stanie zbliżonym do życia, jak to możliwe, zapobieganie autolizie i gniciu oraz ochrona tkanki przed późniejszym przetwarzaniem. Utrwalacze mają różne działania np. sieciowanie, strącanie, koagulacja itp. Mają również różne współczynniki penetracji, zwykle mierzone w głębokości penetracji NA mm na godzinę. Zwykle zalecam mocowanie w 20x objętości utrwalacza do tkanki i mocowanie przez spójne okresy czasu-na przykład zwykle ustalałbym próbki o grubości 0,5 cm w co najmniej jednym wymiarze przez 24 godziny w neutralnej buforowanej formalinie lub przez 6 godzin w płynie buforowym. Następnie przenosiłbym próbki do 70% etanolu (pierwszy etap w wielu rutynowych protokołach przetwarzania parafiny) przed przetworzeniem.

jaka temperatura?

temperatura jest również brana pod uwagę – niska temperatura zmniejszy autolizę w tkankach, ale doprowadzi do wolniejszego współczynnika penetracji, więc wybierz to, co jest dla Ciebie ważne. Zwykle utrwalam w temperaturze pokojowej, z wyjątkiem tkanek, które mają być przetwarzane na żywicę lub dla niektórych wrażliwych antygenów, w których zalecane jest mocowanie w niskiej temperaturze.

wybór zależy od końca

wybór utrwalacza jest określony przez punkt końcowy – na przykład, jeśli bardzo wysoki stopień zachowania morfologicznego jest wymagany do mikroskopii świetlnej lub elektronowej na odcinkach żywicy, prawdopodobieństwo jest takie, że utrwalacz na bazie gluteraldehydu (być może w połączeniu z paraformaldehydem) byłby metodą wyboru. Ponieważ żadne z nich nie są skuteczne w zachowaniu lipidów (które zostałyby utracone w późniejszym przetwarzaniu na żywicę lub plastik), tkanka musiałaby zostać utrwalona w tetroksydzie osmu.

słowo lub dwa o aldehydu glutarowym

ponieważ aldehyd glutarowy powoli wnika w tkankę, kawałki tkanki muszą być znacznie mniejsze lub czasy fiksacji znacznie dłuższe. Jednak, jak wiele rzeczy w życiu, istnieje kompromis dla uzyskania tego wysokiego stopnia zachowania morfologicznego-Generalnie o wiele trudniejsze jest wykonanie empirycznych technik barwienia (takich jak Hematoksylina i Eozyna, PAS itp.) lub technik badania tkanek molekularnych z wykorzystaniem przeciwciał (immunohistochemia itp.) lub sondy kwasu nukleinowego (hybrydyzacja in-situ) itp.

Brrr-zimny świat kriostatu!

drugim końcem wagi jest użycie zamrożonych (lub kriostatów) sekcji bez lub minimalnej fiksacji. Na przykład zamrożona sekcja może być suszona powietrzem na szkiełku i bezpośrednio barwiona. W związku z tym, to nie miał narażenia chemicznego utrwalaczy lub alkoholi, rozpuszczalników i ciepła, które jest związane z przetwarzaniem parafiny. Dla niektórych technik ma to ogromne zalety, np. demonstracja lipidów, immunohistochemii i immunofluorescencji dla niektórych antygenów oraz dla tkanki mózgowej, gdzie może dawać doskonałe wyniki. Jednak ogólnie uboższa morfologia uzyskana dla innych tkanek ogólnie sprawia, że jest to mniej powszechne.

polityczna fiksacja

podobnie jak nasi politycy, większość z nas próbuje odwołać się do środka! Na razie środkiem w utrwalaniu jest tkanka osadzona w parafinie formaliny. Jest szeroko stosowany w patologii diagnostycznej-patolodzy są zaznajomieni z chromatynowym wzorem utrwalonych w ten sposób tkanek i zapewnia dobry stopień zachowania morfologicznego i chemicznego, tak że białka są dobrze zachowane, chociaż często maskowane (które można cofnąć) i mRNA i DNA mogą być również hybrydyzowane.

różne dyscypliny, różne preferencje

producenci przeciwciał często podają warunki stosowania na tkankach FFPE, prawdopodobnie dlatego, że zoptymalizowali i zwalidowali te odczynniki na tym łatwo dostępnym typie próbki. Ale podobnie jak partie polityczne, różne dyscypliny mają różne preferencje! Na przykład, do badania makrofagów w jednym z naszych ośrodków badawczych, metakarn jest utrwalaczem z wyboru.

jedno rozwiązanie, aby je wszystkie naprawić? Nie do końca …

jednak, jak mówi tytuł „think before You fix” nie oznacza to, że 4% neutralny buforowany formaldehyd jest najlepszym utrwalaczem dla każdej aplikacji, może w rzeczywistości być szkodliwy dla uzyskania najlepszych wyników w eksperymencie opartym na przeciwciałach, a nawet dla zachowania morfologicznego. Na przykład we wczesnych latach 90-tych badałem spermatogenezę i dlatego pracowałem nad jądrami. Jądro jest dość płynnie wypełnionym narządem z heterogeniczną populacją komórek zawartych w dwóch głównych komorach, kanalikach i śródmiąższu.

tkanka

u szczura występuje 14 stadiów spermatogenezy, dzięki czemu w każdym przekroju jądra kanaliki nasienne można scharakteryzować jako jeden z 14 stadiów. Etapy te wyróżniają się subtelnymi różnicami w wyglądzie morfologicznym różnych typów komórek. W jądrze chciałem przyjrzeć się ekspresji mRNA za pomocą hybrydyzacji in-situ-większość literatury zalecała 4% paraformaldehydu do hybrydyzacji in-situ, więc jaki środek utrwalający wybrałem? Odpowiedź jest oczywiście, wybraliśmy, dobrze……… kilka! Przynajmniej dla wstępnej oceny – powodem było to, że z opublikowanej literatury można było zobaczyć, że paraformaldehyd nie daje stopnia zachowania morfologicznego, który był potrzebny do rozpoznania subtelnych różnic w populacji komórkowej jąder.

mamy kilkadziesiąt lat, ale nadal dajemy wyniki

moglibyśmy otrzymać sygnał mRNA, ale gdybyśmy nie mogli dokładnie zidentyfikować rodzaju komórki i etapu spermatogenezy, otrzymana informacja byłaby mało wartościowa. Wybraliśmy kilka i ostatecznie wybraliśmy płyn Buinsa, który chociaż dawał nieco mniej wrażliwy sygnał przez ISH, dawał zachowanie morfologiczne potrzebne do określenia, na którym etapie spermatogenezy gen został wyrażony. Być może miałem szczęście, ponieważ te 20-letnie próbki mogą być nadal używane do ISH dzisiaj i okazało się, że w moich rękach jest niezwykle dobrym utrwalaczem dla immunohistochemii.

Suck it and see!

polecam naprawic wszystko w Bouins? Oczywiście, że nie! Był to idealny środek utrwalający dla naszej tkanki i pożądanego punktu końcowego, ale nie oznacza to, że jest idealny do każdego zastosowania. Znalezienie idealnego utrwalacza może obejmować wypróbowanie różnych sposobów mocowania próbek, przygotowanie ich na różne sposoby i zastosowanie różnych strategii barwienia.

początkowy fundament

w większości zastosowań, trzymanie się środka, na pewno początkowo, jest dobrą strategią utrwalania, ale jeśli nie daje Ci punktu końcowego, którego potrzebujesz, lub po prostu nie działa, zachowaj otwarty umysł i zbadaj różne strategie utrwalania, aby uzyskać najlepsze wyniki. Zrób to w pobliżu początku projektu, w którym masz możliwość zmiany kierunku.

wreszcie …

i wreszcie, po dokonaniu wyboru fiksacji (np. utrwalacz, czas i temperatura), a następnie zachować spójność i, kto wie, nadal można używać tych próbek za 20 lat!

czy to ci pomogło? Następnie podziel się z siecią.

autor: Mike Millar
Autor zdjęcia: euthman

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.