Menu główne

reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) od dziesięcioleci pozostaje niezwykle ważnym narzędziem laboratoryjnym. W tym przedziale zaszły subtelne zmiany w enzymach i drastyczne zmiany w wykrywaniu wyniku, ale narzędzie i jego niezawodność pozostały niezwykle spójne.

zawsze są komentarze takie jak ten poniżej, który konkretnie porusza temat znalezienia materiału genetycznego MERS-CoV u osób bezobjawowych lub lekko chorych. W zasadzie zastanawiają się nad wiarygodnością PCR.

według mojej wiedzy „infekcja” jest definiowana jako dowód na obecność czynnika zakaźnego i dowód namnażania się tego czynnika w organizmie (lub związana z tym reakcja zapalna, którą można powiązać z tym czynnikiem). Dlatego moje pytanie brzmi: gdzie został pobrany okaz od pielęgniarek „bezobjawowych”? PCR, jak wszyscy wiemy, wykrywa kwasy nukleinowe. Jeśli więc nie można udowodnić namnażania i nie ma lokalnej lub ogólnoustrojowej odpowiedzi zapalnej, to w jaki sposób wykluczono” skażenie ” (niezależnie od tego, czy jest to spowodowane inaktywowanymi częściami MERS-CoV, czy nawet kompletnymi cząsteczkami wirusa)? Nie jest to tylko pytanie semantyczne, ale powinno mieć wpływ na zgłaszaną liczbę „przypadków”.

Prof Martin Haditsch piszący w ProMED

mam z nich wrażenie, że niektórzy nie ufają wynikom PCR, a może wynikom-getterom. Same wyniki PCR nie spełniają potrzeby zobaczenia replikującego się wirusa w gospodarzu przed przypisaniem jakiejkolwiek roli przyczynowej temu wirusowi. Jest to jednak często niepraktyczne i często niepotrzebne, ponieważ pozytywny wynik PCR jest na ogół wiarygodnym wskaźnikiem obecności aktywnej infekcji wirusowej.

Kulturowanie izolatu też nie przypisywałoby przyczynowości pedantowi. To tylko dowodzi, że wirus był w próbce pacjenta. Podobnie pozytywny wynik serologiczny wykrywa przeciwciała przeciwko wirusowi, udowadniając tylko, że został rozpoznany przez układ odpornościowy zakażonego pacjenta w pewnym momencie. Badania potrzebne do udowodnienia przyczynowości są zwykle na dole listy priorytetów w fazie zarządzania zdrowiem publicznym, takiej jak w momencie pojawienia się nowego wirusa. Najlepsza istota (całkowicie nieetyczna) infekcja człowieka, a następnie infekcja innych naczelnych, a następnie, przesuwając się w dół listy istotności, do innych futrzastych stworzeń, które mogą być odpowiednim pomocnikiem w chorobie u ludzi.

Płyta reakcyjna PCR.
zdjęcie Davida z Flickr

nie ma łatwej odpowiedzi na powyższy problem. Wiele kręci się wokół słów, pedanterii, wytycznych, zasad i kryteriów. Często są one poparte wieloma różnymi badaniami epidemiologicznymi, które w dużej mierze opierają się na dobrych wynikach laboratoryjnych. Wyniki takie jak te dostarczone przez PCR. Jak wiemy, postulaty kocha (oprócz zastosowania do bakterii i bycia tylko przewodnikiem) nie trzymają się zbyt dobrze w molekularnym świecie nowej i powstającej wirusologii. Istnieją jednak modyfikacje postulatów.

inne kolekcje, takie jak Bradford Hill criteria, mają dziś więcej runów. Z pewnością nie można przetestować grypy lub CoV, które zabijają 20-50% przypadków, w których się znajdują, używając ludzkich ochotników w celu odtworzenia choroby i udowodnienia, że czynnik był odpowiedzialny.

zebrałem kilka rozważań na temat roli i niezawodności PCR na liście.

co to jest PCR (szybka wersja)

PCR to napędzany enzymem cykliczny proces gotowania i chłodzenia, który wzmacnia wstępnie zdefiniowany odcinek DNA za pomocą pary jednakowo zdefiniowanych i komercyjnie wykonanych oligonukleotydów (krótkich odcinków DNA), które nazywamy starterami (inicjują proces kopiowania DNA, który stanowi podstawę amplifikacji). Dodaj wcześniej krok odwrotnej transkrypcji i możesz użyć PCR do amplifikacji DNA z predefiniowanego szablonu RNA (szablon jest rzeczą, którą kopiujemy i wzmacniamy).

Uwaga Boczna #1 – wirusy pochodzą z genomów DNA lub RNA. Pozytywny wynik PCR nie dowodzi aktywnej replikacji wirusa. Nie dowodzi obecności wirusa zakaźnego. Dlatego wolimy mówić o wirusie wykrywanym u pacjentów stosujących PCR. Niektórzy odnoszą się do wyniku dodatniego PCR jako „izolat wirusowy” – nie. powinno to być zarezerwowane do opisania udanego wzrostu wirusa przy użyciu hodowli komórkowej / tkankowej/narządowej.

PCR podwaja liczbę sztuk docelowego DNA (kopii lub amplikonu-czyli kopii DNA pojedynczego gatunku) w każdym cyklu (1 cykl = runda ogrzewania i chłodzenia). Im więcej DNA / RNA, które zaczynasz (zwykle odpowiada wiremii) w próbce pacjenta, tym szybciej otrzymasz wystarczającą liczbę kopii do pomiaru za pomocą wybranej metody wykrywania (dziś głównie sygnał fluorescencji). Mam stronę na temat mechaniki PCR tutaj

z PCR, znajdujemy wirusa częściej

późno, z wykorzystaniem bardzo wrażliwych metod PCR w badaniach wirusów oddechowych jest powszechne, badania częściej wykryto wirusa wśród osób z próbkami bez objawów choroby…również nie zawsze bezpośrednio przed lub po, jeśli ludzie są uważnie śledzone. Po co próbkować kogoś, jeśli nie jest chory? Dobre pytanie. Możesz chcieć sprawdzić, czy transmisja występuje, nawet jeśli choroba nie. Ale w przeszłości, używając stosunkowo niewrażliwych metod hodowli wirusów, bylibyśmy mniej skłonni do wykrycia wirusa.

notka Boczna #2 – jeśli chcemy uznać taką osobę za „bezobjawową” – lepiej mieć całkowitą pewność, że nie ma absolutnie żadnych objawów infekcji. Choroba, odchylenie od normalnego funkcjonowania organizmu, może być tak łagodne, jak ból głowy lub po prostu uczucie krzywizny-i nadal, pedantycznie, być chorobą przypisaną wirusowi wykrytemu przez PCR. Załóżmy, że poziom opieki został podjęty (często nie został)

Uwaga #3 – jesteśmy platformami spacerowymi dla wirusów, bakterii i grzybów. Spójrz na ten artykuł od Erica Delwarta; U 2 dzieci-92% z 72 próbek pobranych tygodniowo przez ponad 250 dni było dodatnich wirusowo (w tym czasie nie wystąpiły żadne lub łagodne objawy choroby)! Jest bardzo prawdopodobne, jak odkryjemy bardziej zróżnicowanych agentów, lepiej scharakteryzować je i rozwijać (i używać) ulepszone możliwości, że dowiemy się, że prawie nigdy nie jesteśmy bez pasażera lub 3. A jednak nie zawsze jesteśmy chorzy-dlaczego tak jest?

układ odpornościowy na ratunek! Mamy bardzo zdolny, aktywny i wielofunkcyjny układ odpornościowy. Jest ciągle kwestionowany przez … rzeczy-nie tylko wirusy, bakterie i grzyby, ale chemikalia, różne białka, węglowodany, alergeny, brud i kurz (złożony z kawałków wszystkich innych rzeczy) i robi świetną robotę sortowania przez to wszystko, odpowiadając na to, czego potrzebuje, aby zapobiec chorobom i zwykle zgniatając odpowiedź na resztę w taki sposób, że nie wykonujemy niedoczynności 24/7 z powodu alergii i choroby. To z powodu tego złożonego systemu nie powinniśmy się dziwić, że ponieważ technologia pozwala nam znaleźć niższy poziom czynników zakaźnych, jest całkowicie uzasadnione, aby być „zainfekowanym”, ale nie chorym. Przynajmniej w pewnej części naszych spotkań z wirusami, nie powinno to być zaskoczeniem.

mamy dużą ekspozycję na wirusa

myślę, że warto podkreślić, że wdychamy do 60 litrów powietrza na minutę, z 0,1-7200 cząsteczek submikronowych (aerozolizowanych; 0,3-0,5 µm) na litr. W jednym badaniu RNA wirusa grypy stwierdzono częściej w cząsteczkach ≤5µm niż w cząsteczkach większych niż 5µm. Te małe cząstki mogą być wdychane i wydychane dość łatwo i powszechnie. To tylko podkreśla, jak powszechne jest prawdopodobnie wdychanie wirusów do naszych dróg oddechowych

i przenoszenie w przypadkach bezobjawowych. Nie mam żadnych danych na ten temat, ale wydaje mi się, że jeśli wymaz z górnych dróg oddechowych, wymaz z miejsca, z którego wirus jest łatwo kaszleć, kichnąć i dlatego przenoszone w większych cząsteczkach. Jeśli wirus zostanie tam wykryty, wydaje się, że istnieje duża szansa na transmisję. Czy to się zdarza? Te badania nie są łatwo widoczne … a może nie zostały wykonane.

ale skażenie!

duży szary amlikon orzechowy w pokoju jest skażony. To jest amplikon z poprzednich reakcji PCR, który przypadkowo dostaje się do nowych odczynników/pipet/laboratorium PCR i daje nam pozytywny wynik, gdy pacjent nie jest zainfekowany. Niektórzy myślą o tym, gdy dodatni wynik PCR występuje u osoby bezobjawowej. Łatwo jest wskazać na to jako powód nieprzyjemnego wyniku. Jednakże, jeśli laboratorium jest ekspertem w PCR, to niezbędne kontrole będą na miejscu, aby dać ostrzeżenie o zanieczyszczeniu.

Plus, w przypadku niektórych wirusów i w niektórych laboratoriach, stosuje się więcej niż jeden test PCR, z których każdy celuje w różne regiony genetyczne i używa oddzielnych starterów. Tak jest w przypadku zalecanego przepływu pracy dla badań przesiewowych MERS-CoV. Nie oznacza to oczywiście, że są to testy stosowane. I szukać szczegółów na temat procesu testowania używane jest zawsze przydatne do zrozumienia kontekstu wyniku PCR.

inne przydatne kroki obejmują oddzielne laboratoria do przygotowania próbek, przygotowania mieszanki reakcyjnej i cykli; laboratoria z kierunkowym przepływem powietrza i pracy; jednorazowe wszystko; odczynniki handlowe; gotowe, specyficzne dla celu zestawy („anality”); wiele negatywnych kontroli i tak dalej. Zapewniają one znaczne zaufanie do wyniku PCR i są standardową praktyką roboczą dla profesjonalnego laboratorium diagnostycznego PCR. Pomocne jest również pobranie więcej niż jednej próbki z podejrzanego przypadku.

laboratoria PCR potrzebują regałów. Kolorowe stojaki gwarantują sukces PCR!
zdjęcie z MadLab Manchester Digital Laboratory na Flickr.

istnieje duże doświadczenie w świecie PCR

PCR jest używany do wykrywania wirusów od 1980 roku i istnieje wielu bardzo doświadczonych ekspertów w jego użyciu, którzy wiedzą, jak uzyskać wiarygodne wyniki i uniknąć zanieczyszczenia. Istnieje również wiele publikacji, które łączą zakaźnego wirusa z wynikiem PCR-pozytywność PCR ma znaczenie i literatura to potwierdza.

Ci z nas, którzy przeprowadzili eksperymenty PCR na próbkach ludzkich przez wiele lat, będą wiedzieć, że PCR nie jest tak praktycznie wrażliwy, że będzie regularnie wykrywał wirusa, który po prostu siedzi w nosie, ponieważ był wdychany, ale nie replikuje się. Współczynniki rozcieńczenia to sprawdzają.

jednak zdarzają się problemy i istnieją nieprofesjonalne laboratoria. Nie ma łatwej odpowiedzi na pytania Prof Martina Haditscha dotyczące ProMED. Jak w przypadku każdego testu, niezawodność polega na zmniejszeniu ryzyka awarii w procesie. Ale nawet laboratoria ekspertów mają złe dni.

  1. MERS-CoV – EASTERN MEDITERRANEAN (34): ARABIA Saudyjska, WHOhttp://www.promedmail.org/post/1788112
    związek między ostrym wiotkim zapaleniem rdzenia (AFM) a enterowirusem D68 (EV-D68) – jakie są dowody na związek przyczynowy?
    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29386095
  2. enterowirus D68 i ostre wiotkie zapalenie rdzenia-ocena dowodów na przyczynowość
    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29482893

*importowany Post

  1. ten post z 27JUN2013 został opublikowany na mojej starej platformie blogowej virologydownunder.blogspot.com.au. został przeniesiony tutaj i lekko edytowany.

odsłony: 9785

jak wczytywanie…

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.