dwukolorowy multipleksowany system testu immunologicznego bocznego przepływu w celu różnicowego wykrywania ludzkich gatunków malarii na pojedynczej linii testowej

zasada dwukolorowego LFA w multipleksowanym wykrywaniu antygenów malarii na pojedynczej linii testowej paska LFA

w LFA, gdy próbka cieczy jest dozowana na podkładce i przepływa do koniugatu Pad, niebieskie i czerwone cząsteczki lateksu wychwytują odpowiednio antygeny pldh i pfhrp2. Antygeny związane z cząstkami lateksu są następnie transportowane przez pasek i wykrywane na linii testowej, gdzie funkcjonalizuje się mieszanina przeciwciał wykrywających (pan)pLDH i PfHRP2 (Fig. 1). Zmiana profili barwnych opracowanych na obszarze testowym odpowiada liczbie wychwyconych niebieskich i czerwonych cząstek lateksu.

skuteczność dwukolorowego LFA wykazano po raz pierwszy poprzez wykrycie rekombinowanych antygenów malarii wzbogaconych w buforze do przemywania w różnych stężeniach. Przetestowano trzy różne scenariusze diagnostyczne: tylko pLDH, tylko PfHRP2 i jednoczesne zakażenie Pldh-PfHRP2. W celu jednoczesnego wykrycia pLDH i PfHRP2 zmieszano w stosunku molowym od 1 do 6, aby naśladować próbki kliniczne zakażenia P. falciparum . Piętnaście minut po dozowaniu próbki, a następnie płukaniu buforowym, zarejestrowano profile kolorów w obszarach testowych. Gdy próbka zawierała tylko pLDH, zaobserwowano niebieskie linie testowe (rys. 2A). Przy jednoczesnej detekcji obszar badany wykazywał barwę mieszaniny niebieskiego i czerwonego (rys. 2b). Tylko dla próbek PfHRP2 linie badawcze zmieniły kolor na czerwony (rys. 2c). Linie kontrolne na wszystkich paskach LFA pokazywały kolor mieszany niebieski i czerwony, wskazując, że zarówno czerwone, jak i niebieskie cząstki lateksu były transportowane przez paski.

ys. 2
rys. 2

reprezentatywne paski testowe dwukolorowego LFA. Na liniach testowych zaobserwowano wyraźne kolory odpowiadające typowi antygenów, takie jak niebieskie linie testowe wyłącznie do wykrywania pLDH, barwa mieszaniny B linii testowych do jednoczesnego wykrywania i c czerwone linie testowe tylko do wykrywania PfHRP2. Barwa mieszaniny na liniach kontrolnych wskazywała, że czerwone i niebieskie cząstki lateksu migrują wzdłuż długości paska

cechy w profilach kolorów pasków LFA

w celu wdrożenia metody ilościowej i jakościowej w teście przeanalizowano profile intensywności pasków LFA. Obrazy pasków zostały uzyskane za pomocą 8-megapikselowej tylnej kamery iPada Air 2 w tych samych białych warunkach oświetleniowych LED. Odległość między linią testową a linią kontrolną wynosiła około 200 pikseli, a szerokość linii wynosiła około 50 pikseli na obrazach. Aby uzyskać profile kolorów RGB, obrazy zostały otwarte za pomocą oprogramowania ImageJ i wykonane polecenie „Color Profiler”. Dla uproszczenia analizowano jedynie profile intensywności koloru czerwonego i niebieskiego, ponieważ profile intensywności koloru Zielonego nie miały znaczącego wpływu na rozróżnianie kolorów czerwonego i niebieskiego i stanowiły wartość pomocniczą w obrazach kolorowych. Nitrocelulozowa membrana paska testowego była biała, co skutkowało wysoką intensywnością tła. Kolory z kontrastem na liniach testowych i kontrolnych generowały piki zbutwiałe z intensywności tła (rys. 3).

ys. 3
rys. 3

czerwone i niebieskie profile intensywności pasków testowych. Profile kolorów RGB uzyskano z obrazów pasków z Rys. 2. Dla uproszczenia przedstawiono intensywność koloru czerwonego i niebieskiego, z wyjątkiem intensywności koloru zielonego. a kiedy niebieskie kolory pojawiły się na liniach testowych, intensywność Czerwieni była bardziej zepsuta niż intensywność niebieska. Trend ten był spowodowany tym, że tło białego paska zachowało wysokie wartości RGB. b gdy na liniach testowych pojawił się kolor mieszaniny, wytworzyły się piki czerwone i niebieskie odpowiadające stężeniu antygenów. c tylko dla wykrywania PfHRP2 niebieskie piki były bardziej zbutwiałe niż piki czerwone, w odwrotnej obserwacji z

zaobserwowano dwie intrygujące cechy w profilach kolorów. Po pierwsze, gdy niebieskie linie testowe pojawiły się na paskach, czerwone piki intensywności były bardziej zbutwiałe niż niebieskie piki w profilach kolorów. Dzieje się tak dlatego, że niebieski kolor zachował stosunkowo wyższe wartości niebieskiego piksela niż wartości czerwonego. Rysunek 3 przedstawia profile intensywności czerwonych i niebieskich pasków wyodrębnionych z obrazów na Fig. 2. W przypadku wykrycia pLDH tylko wtedy, gdy zaobserwowano silne niebieskie linie testowe, intensywności czerwone były znacznie zaniżone w stosunku do intensywności górnego tła, więcej niż niebieskich pików (Fig. 3A). W tym samym kontekście wykrywanie PfHRP2 z widocznymi czerwonymi liniami testowymi na obrazach generowało niższe niebieskie piki niż czerwone piki (rys. 3c).

inną cechą profili barwnych były niespecyficzne piki barwne na Rys. 3A (intensywność niebieska) i Rys. 3C (intensywność czerwieni), które nie były związane z rozwojem koloru przez cząstki lateksu. Gołym okiem nie obserwowano niespecyficznego wiązania lub reaktywności krzyżowej na liniach testowych. Rzeczywiście, Fig. 2 wykazały wyraźne rozróżnienie kolorów dla każdego trybu wykrywania. Jednak niespecyficzne piki intensywności zostały opracowane przez kontrast obrazu. W miarę jak cząstki lateksu gromadziły się na liniach testowych, ciemność rosła, co skutkowało zmniejszaniem wartości RGB. Tak więc wszystkie piki intensywności na Fig. 3 nie były z czystych kolorów, ale miały wpływ na kontrast obrazu. Nie było łatwo oddzielić kontrast i czystą barwę od obrazów. Jednak prosta funkcja korelacji została ustalona przez obliczenie stosunku czerwonych do niebieskich obszarów rozpadu w celu rozróżnienia typu koloru. Zostało to omówione i omówione w następnej sekcji.

granica wykrywalności i granica rozróżnienia barw

w celu dalszej analizy pasków, uniknięcia subiektywności i potwierdzenia wizualnej granicy wykrywalności, obliczono obszary zaniku pików czerwonych i niebieskich z Fig. 3. Aby obliczyć obszary szczytowe, wyrównanie szczytowe zostało po raz pierwszy wykonane na intensywności tła. Następnie zasada Simpsona 3/8 została zastosowana do wyrównanych pików dla całkowania numerycznego do obliczania obszarów.

wykresy wynikowe na Rys. 4 wykazał obszary czerwonych i niebieskich pików na liniach testowych jako funkcję stężeń antygenu z trzech niezależnych eksperymentów. Zarówno czerwone, jak i niebieskie obszary rozpadu zwiększały się wraz ze wzrostem stężenia antygenu. Jednak stopień zaniku obszarów zależy od rodzaju kolorów opracowanych na liniach testowych. Dla próbek pLDH tylko czerwone obszary rozpadu były wyższe niż niebieskie (rys. 4a), podczas gdy tylko próbki PfHRP2 wykazywały przeciwną tendencję (rys. 4c). Aby zweryfikować skuteczność testu, granicę wykrywalności (LoD) oszacowano poprzez zastosowanie podejścia standardowego zdefiniowanego jako średnia plus trzykrotność odchylenia standardowego (snon-target + 3SD) sygnału próbki ślepej. LoD, przy którym wszystkie sygnały czerwone i niebieskie były odróżniane od sygnałów ślepej próbki, oszacowano na 31,2 ng mL−1 we wszystkich scenariuszach detekcji (wstawione dane na Fig. 4).

ys. 4
rys. 4

Obliczanie czerwonych i niebieskich obszarów rozpadu na liniach testowych. Czerwone i niebieskie obszary rozpadu obliczono z Fig. 3 tylko dla wykrywania pLDH, B jednoczesne wykrywanie pLDH i PfHRP2 oraz c tylko wykrywanie PfHRP2. Różne stopnie obszarów rozpadu pomiędzy intensywnością czerwoną i niebieską obserwowano w zależności od typów próbek i stężeń. Wstawione wykresy powiększono przy niższych stężeniach. LoD dla odróżnienia od próbek niedocelowych wynosił 31,2 ng mL−1 dla wszystkich trybów detekcji. Paski błędów wskazują odchylenia standardowe z trzech eksperymentów

następnie obliczono stosunek obszarów rozpadu czerwonego do Niebieskiego, aby zapewnić prostą metodę dyskryminacji kolorów (rys. 5). Zgodnie z oczekiwaniami, współczynniki rozpadu wzrastały wraz ze wzrostem stężenia pLDH, które przypisywały intensywności koloru czerwonego (górna krzywa na Fig. 5). Obszar powyżej górnej niebieskiej krzywej jest tylko regionem pLDH, wskazując P. falciparum ujemny.

ys. 5
rys. 5

Prosta funkcja współczynników kolorów obliczonych z Rys. 4 zapewniło kryterium rozróżniania kolorów w funkcji stężeń próbek. Niebieska krzywa z kółkami znajdowała się nad pozostałymi krzywiznami, co wskazywało na mocne niebieskie kolory. Dla niebieskiej krzywej stężenia pLDH pokazano w osi X. Środkowa krzywa ze znacznikami diamentowymi była krzywą pośrednią między górną i dolną krzywą i reprezentowała kolory mieszane czerwony i niebieski. Dla krzywej Środkowej stężenia PfHRP2 pokazano w osi x, a pldh / PfHRP2 mieszano w stosunku 1: 6. Dolna krzywa wskazywała na silne czerwone barwy. Dla czerwonej krzywej stężenia PfHRP2 pokazano w osi X. Strzałki na wstawionym wykresie pokazywały granicę rozróżnienia kolorów, od których odróżniały się barwy niebieskie od czerwonych. Paski błędów są standardowymi odchyleniami od eksperymentów w trzech egzemplarzach

natomiast wartości współczynnika zmniejszały się wraz ze wzrostem stężenia PfHRP2 (dolna krzywa na Fig. 5). Obszar poniżej dolnej czerwonej krzywej zawiera tylko PfHRP2. Ponieważ pLDH jest specyficzny dla pan, powinien być zawsze obecny w przypadku przypadków malarii dodatnich. W przypadku wszystkich czterech ludzkich gatunków malarii wynik nie spadnie tylko do regionu PfHRP2.

współczynniki rozpadu w jednoczesnej detekcji były pośrednie i zawarte między górną krzywą a dolną krzywą na Fig. 5, wskazując, że powinien to być kolor mieszany niebieski i czerwony. Obszar między górną niebieską krzywą a dolną czerwoną krzywą zawiera zarówno pLDH, jak i PfHRP2, co wskazuje na P. falciparum dodatni.

oszacowano granicę rozróżnienia barw, gdzie kolory czerwony i niebieski były rozróżniane przy użyciu tej samej definicji LoD. Można zauważyć, że górna krzywa na Fig. 5 była zawsze wyższa od wartości plus 3SD krzywej dolnej po 7,8 mg mL−1, ustalonej jako granica rozróżnienia kolorów (wstawiony rysunek na Fig. 5).

Walidacja dwukolorowego LFA poprzez badanie próbek klinicznych

w przypadku 15 badanych próbek ujemnych intensywność barwy jest niższa od LoD zarówno dla pLDH, jak i PfHRP2 i dlatego jest uważana za ujemną dla malarii. W celu rozróżnienia typów infekcji i oszacowania stężenia antygenu w 10 próbkach z dodatnim wynikiem malarii przeprowadzono dyskryminację barwną z wartościami RGB z analizy ImageJ. Ponieważ pLDH jest specyficzny dla pan i wiąże się ze wszystkimi gatunkami malarii, można się spodziewać obecności pLDH we wszystkich próbkach z dodatnim wynikiem malarii. Stężenie pLDH można oszacować za pomocą odpowiednich czerwonych obszarów rozpadu za pomocą krzywej kalibracyjnej na Fig. 4. W przypadku wszystkich próbek z dodatnim wynikiem malarii przyjęto czteroetapową metodę prób i błędów w celu ustalenia, czy próbka jest P. falciparum, czy nie P. falciparum (tj. vivax, P. ovale lub P. malariae).

  • Krok 1: ImageJ jest używany do obliczania czerwonych i niebieskich obszarów rozpadu dla linii testowej, następnie stosunek czerwonych do niebieskich obszarów rozpadu został obliczony i zdefiniowany jako ratio_cal.

  • Krok 2: ponieważ pLDH występuje we wszystkich dodatnich próbkach klinicznych, Załóżmy, że próbka zawiera tylko pLDH i skoreluj czerwone obszary rozpadu zmierzone w Kroku 1 ze stężeniami pLDH, z krzywą kalibracji na Fig. 4a.

  • Krok 3: Znajdź wartość stosunku czerwonych do niebieskich obszarów rozpadu (oś y) na górnej niebieskiej krzywej na Fig. 5 przy obliczonym stężeniu pLDH (z Kroku 2) i zdefiniuj je jako ratio_ref.

  • Krok 4: będzie składał się z dwóch scenariuszy: (1) Jeśli ratio_cal ≥ ratio_ref, próbka spada w obszar powyżej górnej niebieskiej krzywej na Fig. 5 (tylko region pLDH), co wskazuje na brak P. falciparum, ale obecność malarii (P. vivax, P. ovale lub P. malariae). W tym scenariuszu szacowane stężenia pLDH z Etapu 2 są ważne, ponieważ próbki zawierają tylko pLDH; (2) Jeśli ratio_cal <ratio_ref, to próbka spada w obszar między górną niebieską krzywą a dolną czerwoną krzywą na Fig. 5 (region Pldh + PfHRP2), co wskazuje na P. falciparum dodatni. W tym scenariuszu szacowane stężenia pLDH z Etapu 2 nie są prawidłowe, ponieważ próbki zawierają pLDH i PfHRP2 oraz krzywą kalibracyjną na Fig. 4a nie może być stosowany. Interpretacja Koloru mieszanego była skomplikowana i prawdopodobnie tendencyjna ze względu na kontrast obrazu. Nie było również łatwo stworzyć standardowe krzywe, które mogą obejmować każdy scenariusz kombinacji kolorów.

czerwone i niebieskie obszary rozpadu oraz współczynniki barwy próbek P. falciparum dodatnich i P. vivax dodatnich przedstawiono odpowiednio w tabelach 1 i 2.

Tabela 1 Wyniki analizy obrazu oraz oceny stężenia antygenu i rodzaju zakażenia malarią z próbek klinicznych Plasmodium falciparum dodatnich
tabela 2 wyniki analizy obrazu i oszacowania stężenia antygenu i rodzaju zakażenia malarią z próbek klinicznych Plasmodium vivax

jak pokazano w tabeli 1, 5 próbek potwierdzono wynikiem dodatnim P. falciparum za pomocą badania mikroskopowego. Stosując przedstawioną powyżej czteroetapową metodę prób i błędów, współczynnik odniesienia czerwieni do błękitu (ratio_ref) oszacowano na odpowiednim obszarze rozpadu Czerwieni za pomocą krzywych kalibracyjnych pLDH i porównano ze stosunkiem czerwieni do niebieskiego próbek klinicznych (ratio_cal). Ponieważ ratio_cal < ratio_ref dla wszystkich 5 próbek wymienionych w tabeli 1, Wszystkie próbki są objęte scenariuszem drugim w etapie 4, jak opisano powyżej. Następnie można stwierdzić, że próbka jest P. falciparum dodatnia. Na przykład, próbka nr 25 jest potwierdzona jako P. falciparum dodatni przez mikroskopię. Czerwony obszar rozpadu i niebieski obszar rozpadu na linii testowej wynoszą odpowiednio 917,11 i 499,20. Stosunek czerwonych do niebieskich próbek nr 25 (ratio_cal) wynosi zatem 1,84. Stosunek odniesienia czerwieni do niebieskiego w odpowiednim obszarze rozpadu Czerwieni (917.11) (ratio_ref) oblicza się za pomocą krzywej kalibracyjnej pLDH na Fig. 4a, a wartość wynosi 1,95. Od 1,95 (ratio_ref) > 1,84 (ratio_cal), próbka nr 25 zostaje potwierdzona jako pozytywna P. falciparum przez dyskryminację barwną LFA. Zgadza się to zarówno z wynikami mikroskopii, jak i ELISA.

jak pokazano w tabeli 2, 5 próbek potwierdzono jako P. vivax pozytywny przez badanie mikroskopowe. Podobnie otrzymano ratio_ref i ratio_cal. Ponieważ ratio_cal > ratio_ref dla wszystkich 5 próbek wymienionych w tabeli 2, wszystkie próbki należą do regionu tylko pLDH, co wskazuje na obecność malarii dodatnią, ale ujemną dla P. falciparum. W tym przypadku krzywa kalibracyjna pLDH na Fig. 4a można zastosować w celu uzyskania stężeń pLDH dla wszystkich próbek w tabeli 2. Na przykład próbka nr 471 została potwierdzona w mikroskopie jako P. vivax dodatni. Czerwony obszar rozpadu i niebieski obszar rozpadu na linii testowej wynoszą odpowiednio 631,10 i 299,22. Stosunek czerwieni do błękitu próbki nr 471 (ratio_cal) wynosi zatem 2,11. Stosunek odniesienia czerwieni do niebieskiego w odpowiednim obszarze rozpadu Czerwieni (631.10) (ratio_ref) oblicza się za pomocą krzywej kalibracyjnej pLDH na Fig. 4a, a wartość to 1,63. Od 2.11 (ratio_cal) > 1.63 (ratio_ ref), następnie próbka nr 471 została potwierdzona jako malaria dodatnia, ale P. falciparum ujemna przez dyskryminację barwną LFA. Zgadza się to zarówno z wynikami mikroskopii, jak i ELISA.

dla wszystkich próbek w tabeli 2 Należy zauważyć, że wyniki kwantyfikacji pLDH wykazały niezgodność między metodami LFA i ELISA. Szacowane stężenie w LFA było niższe niż w przypadku testu ELISA. Błąd ten można przypisać różnicy krzywych standardowych dla próbki klinicznej buforu i pełnej krwi . Należy również zauważyć dla próbki nr 486, stężenia PfHRP2 przy użyciu metod LFA i ELISA wynoszą odpowiednio 0 i 3,35 ng mL-1, ponieważ 3,35 ng mL-1 jest już poza wartością LoD LFA dla wykrywania PfHRP2.

Dodaj komentarz

Twój adres e-mail nie zostanie opublikowany.