primair Menu

de polymerasekettingreactie (PCR) is decennialang een enorm belangrijk laboratoriuminstrument gebleven. De subtiele veranderingen aan de enzymen en de drastische veranderingen aan de opsporing van een resultaat zijn in die spanwijdte voorgekomen, maar het hulpmiddel en zijn betrouwbaarheid zijn opmerkelijk consistent gebleven.

IMPORTED POST *

Er zijn altijd opmerkingen zoals hieronder die specifiek mijmeren over het vinden van MERS-CoV genetisch materiaal bij asymptomatische of licht zieke mensen. Zij vragen zich fundamenteel bij de betrouwbaarheid van PCR af.

voor zover ik weet wordt” infectie ” gedefinieerd als het bewijs van een infectieus agens en het bewijs van vermenigvuldiging van dit agens in het lichaam (of geassocieerde ontstekingsreactie die aan dit agens kan worden gekoppeld). Daarom is mijn vraag: Waar was het monster genomen van de” asymptomatische ” verpleegkundigen? PCR, zoals we allemaal weten, detecteert alleen nucleïnezuren. Dus als vermenigvuldiging niet kan worden bewezen en er geen lokale of systemische ontstekingsreactie wordt gegeven, hoe werd dan” contaminatie ” (ongeacht of deze te wijten is aan geïnactiveerde delen van MERS-CoV of zelfs volledige virusdeeltjes) uitgesloten? Dit is niet alleen een semantische vraag, maar moet van invloed zijn op het gerapporteerde aantal “gevallen”.

Prof Martin Haditsch schrijven in ProMED

het gevoel dat ik krijg uit deze is dat sommige niet vertrouwen de PCR resultaten of misschien de result-getters. PCR resultaten Alleen niet voldoen aan een behoefte om te zien repliceren virus in een host voor het toewijzen van een soort van causale rol aan dat virus. Maar dat is vaak onpraktisch en vaak onnodig omdat een positief PCR-resultaat over het algemeen een betrouwbare proxy is voor de aanwezigheid van actieve virusinfectie.

Het kweken van een isolaat zou ook geen causaliteit toekennen aan een pedant. Het bewijst alleen dat het virus in het monster van de patiënt zat. Op dezelfde manier detecteert een positief serologisch resultaat antilichamen tegen het virus, wat alleen bewijst dat het op een bepaald moment door het immuunsysteem van een geïnfecteerde patiënt werd herkend. De soorten studies die nodig zijn om daadwerkelijk causaliteit te bewijzen, staan meestal ver beneden de prioriteitenlijst in een fase van volksgezondheidsbeheer, zoals we nu zijn wanneer er een nieuw virus opduikt. De beste is (volledig onethische) infectie bij de mens gevolgd door infectie van andere primaten en dan, het verplaatsen van de relevantie lijst, naar andere harige beestjes die een geschikte stand-in voor ziekte bij de mens kan zijn.

PCR-reactieplaat.
Foto door David van Flickr

Er is geen eenvoudig antwoord om het bovenstaande probleem aan te pakken. Veel draait om woorden, pedant, richtlijnen, leerstellingen en criteria. Vaak worden deze ondersteund door veel verschillende epidemiologische studies die allemaal sterk afhankelijk zijn van goede laboratoriumresultaten. Resultaten zoals die verstrekt door PCR. Zoals we weten, houden de postulaten van Koch (afgezien van het toepassen op bacteriën en het zijn slechts een gids) niet al te goed stand in de moleculaire wereld van nieuwe en opkomende virologie. Er zijn wijzigingen van de postulaten wel.

andere collecties zoals de Bradford Hill criteria krijgen meer run deze dagen. Men kan zeker geen griep of CoV testen die 20-50% van de gevallen doodt waarin het wordt gevonden, met behulp van menselijke vrijwilligers om ziekte te reproduceren en te bewijzen dat de agent verantwoordelijk was.

Ik heb een aantal mijmeringen over de rol en betrouwbaarheid van PCR in een lijst samengebracht.

Wat is PCR (de snelle versie)

PCR is een enzymgedreven cyclisch kook-en koelproces dat een vooraf gedefinieerde strook DNA versterkt met behulp van een paar even vooraf gedefinieerde en commercieel gemaakte oligonucleotiden (korte DNA-rek) die we primers noemen (ze primen het DNA-kopieerproces dat de versterking ondersteunt). Voeg vooraf een omgekeerde transcriptiestap toe en u kunt PCR gebruiken om DNA te versterken dat van een vooraf gedefinieerd malplaatje van RNA wordt gemaakt (malplaatje dat het ding is dat wij kopiëren en versterken).

Side note # 1-virussen komen met DNA-of RNA-genomen. Een positief PCR-resultaat bewijst geen actieve replicatie van een virus. Het bewijst niet dat er besmettelijk virus aanwezig is. Dit is de reden waarom we liever praten over een virus wordt gedetecteerd in patiënten met behulp van PCR. Sommigen verwijzen naar een positief resultaat van PCR als “viraal isolaat” – niet. dit zou moeten worden gereserveerd om de succesvolle groei van eh van een virus te beschrijven gebruikend cel/weefsel/orgaancultuur.

PCR verdubbelt het aantal stukjes doel-DNA (kopieën of amplicon-betekent DNA-kopieën van een enkele soort) elke cyclus (1 cyclus = ronde van verwarming en koeling). Hoe meer DNA / RNA waarmee je begint (meestal gelijk aan de virusbelasting) in je patiëntmonster, hoe eerder je genoeg kopieën krijgt om gemeten te worden met behulp van je detectiemethode naar keuze (tegenwoordig meestal fluorescentiesignaal). Ik heb een pagina over de werking van PCR hier

met PCR vinden we virus vaker

de laatste tijd, met het gebruik van zeer gevoelige PCR-methoden in respiratoire virus onderzoeken gemeengoed, onderzoek studies hebben vaker gedetecteerd virus onder bemonsterde mensen zonder tekenen of symptomen van de ziekte…ook niet altijd onmiddellijk VOOR of na als de mensen zorgvuldig worden opgevolgd. Waarom een monster nemen als ze niet ziek zijn? Goede vraag. Misschien wilt u zien of overdracht plaatsvindt, zelfs als een ziekte dat niet doet. Maar in het verleden, met behulp van relatief ongevoelige viruscultuurmethoden, hadden we minder kans gehad om een virus op te sporen.

Side note #2 – als we op zoek zijn om zo ‘ n persoon “asymptomatisch” te verklaren – kunnen we er maar beter zeker van zijn dat ze absoluut geen symptomen van een infectie hebben. Ziekte, een afwijking van de normale lichaamsfunctie, kan zo mild zijn als hoofdpijn of gewoon een vals gevoel – en nog steeds, pedantisch, een ziekte toegeschreven aan het virus gedetecteerd door PCR. Laten we aannemen dat het niveau van zorg is genomen (vaak niet)

Side note #3 – We lopen platforms voor virussen, bacteriën en schimmels. Neem een kijkje op dit artikel van Eric Delwart; bij 2 kinderen-92% van de 72 monsters die wekelijks werden verzameld gedurende meer dan 250 dagen waren viruspositief (geen of milde tekenen van ziekte ontwikkeld gedurende deze tijd)! Het is zeer waarschijnlijk, als we ontdekken meer diverse agenten, beter karakteriseren hen en ontwikkelen (en gebruiken) verbeterde mogelijkheden, dat we zullen leren we bijna nooit zonder een passagier of 3. En toch zijn we niet altijd ziek – waarom is dat?

immuniteit kan ons goed houden, zelfs als ze geïnfecteerd zijn.

het immuunsysteem komt te hulp! We hebben een zeer capabel, actief en multifunctioneel immuunsysteem. Het wordt voortdurend uitgedaagd door…dingen-niet alleen virussen, bacteriën en schimmels, maar chemicaliën, verschillende eiwitten, koolhydraten, allergenen, vuil en stof (samengesteld uit stukjes van al dat andere spul) en het doet een geweldig werk van sorteren door het allemaal, reageren op wat het nodig heeft om ziekte te voorkomen, en meestal squashing de reactie op de rest op een manier dat we niet onder-presteren 24/7 vanwege allergie en ziekte. Het is te wijten aan dit complexe systeem dat we niet verbaasd dat als de technologie laat ons vinden lagere niveaus van infectieuze agentia, is het volkomen redelijk om te worden “besmet”, maar niet ziek. In ieder geval in een deel van onze ontmoetingen met virussen, zou dit geen verrassing moeten zijn.

we krijgen veel blootstelling aan virus

Ik denk dat het de moeite waard is te benadrukken dat we tot 60 liter lucht per minuut inademen, met 0,1-7200 submicrondeeltjes (aerosolised; 0,3-0,5 µm) per liter. In één studie werd influenza RNA vaker gevonden in deeltjes ≤5µM dan in deeltjes groter dan 5µM. Deze kleine deeltjes kunnen vrij gemakkelijk en algemeen worden ingeademd en uitgeademd. Dit laat alleen zien hoe vaak het waarschijnlijk voor ons is om virussen in onze luchtwegen te inhaleren

Monsterplaats en transmissie in asymptomatische gevallen. Ik heb hier geen gegevens voor, maar het lijkt me dat als je de bovenste luchtwegen uitstrijkt, je de plaats hebt onderzocht waar het virus gemakkelijk wordt opgehoest, geniest en daarom in grotere deeltjes wordt overgedragen. Als daar een virus wordt gedetecteerd, dan lijkt er een goede kans op overdracht mogelijk te zijn. Gebeurt het? Die studies zijn niet gemakkelijk zichtbaar … of misschien zijn ze niet gedaan.

maar de verontreiniging!

De grote grijze pinda-liefhebbende amplicon in de kamer is contaminatie. Dat is amplicon van eerdere PCR reacties die per ongeluk in uw nieuwe PCR reagentia/pipetten/lab en geeft ons een positief resultaat wanneer de patiënt eigenlijk niet besmet. Het is wat sommigen denken van wanneer een PCR positief optreedt in een asymptomatische persoon. Het is gemakkelijk om dit aan te wijzen als een reden voor een onaangenaam resultaat. Echter, als het lab een expert in PCR is, dan zijn de nodige controles aanwezig om te waarschuwen voor besmetting.

Plus, voor sommige virussen en in sommige laboratoria, worden meer dan één PCR-test gebruikt, elk gericht op verschillende genetische gebieden en met behulp van afzonderlijke primers. Dit is het geval met de aanbevolen workflow voor MERS-CoV screening. Het betekent niet dat dit de analyses zijn die natuurlijk worden gebruikt. En kijk voor details over de testworkflow gebruikt is altijd handig om de context van een PCR resultaat te begrijpen.

andere nuttige stappen zijn afzonderlijke labs voor preparaatvoorbereiding, voorbereiding van reactiemix en cycling; labs met gerichte lucht-en werkstromen; wegwerpartikelen; commerciële reagentia; pre-made, doelspecifieke kits (“analyten”); veel negatieve controles, enzovoort. Deze verstrekken aanzienlijk vertrouwen in een PCR-resultaat en zijn standaard het werkpraktijk voor een professioneel kenmerkend PCR-laboratorium. Het nemen van meer dan één monster van een verdacht geval is ook nuttig.

PCR labs hebben rekken nodig. Kleurrijke rekken zorgen voor PCR succes!foto van MadLab Manchester Digital Laboratory op Flickr.

er is veel expertise in de PCR-wereld

PCR wordt gebruikt om virussen op te sporen sinds de jaren tachtig en er zijn veel zeer deskundige deskundigen in het gebruik ervan die weten hoe betrouwbare resultaten te verkrijgen en besmetting te voorkomen. Er zijn ook vele publicaties die infectieus virus met een PCR resultaat verbinden – PCR positiviteit heeft betekenis en de literatuur steunt dat.degenen onder ons die gedurende vele jaren PCR-experimenten met menselijke monsters hebben uitgevoerd, zullen weten dat PCR niet zo praktisch gevoelig is dat het regelmatig een virus detecteert dat gewoon in je neus zit omdat het werd ingeademd maar zich niet repliceert. Verdunningsfactoren zorgen daarvoor.

toch doen zich problemen voor en bestaan er niet-professionele labs. Er is geen eenvoudig antwoord op de vragen van prof. dr. Martin Haditsch op ProMED. Zoals bij elke test gaat betrouwbaarheid over het verminderen van het risico op storingen in het proces. Maar zelfs deskundige laboratoria hebben slechte dagen.

  1. MERS-COV-Oostelijk Middellandse Zeegebied (34): Saoedi-Arabië, WHO http://www.promedmail.org/post/1788112
    het verband tussen acute slappe myelitis (AFM) en Enterovirus D68 (EV – D68) – Wat is het bewijs voor oorzakelijk verband?
    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29386095
  2. Enterovirus D68 and acute slappe myelitis-evaluating the evidence for causality
    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29482893

*Imported Post

  1. Dit bericht van 27JUN2013 werd geplaatst op mijn oude blogplatform virologydownunder.blogspot.com.au. het is nu verplaatst naar hier en licht bewerkt.

Hits: 9785

zoals Laden…

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.