Een twee-kleuren multiplex laterale flow immunoassay systeem differentieel detecteren menselijke malaria soorten op een enkele test lijn

Principe van de twee-kleur PROBLEEMGEBIEDEN in de multiplex detectie van malaria-antigenen op een enkele test lijn van de LFA strip

In de PROBLEEMGEBIEDEN, wanneer het monster van de vloeistof is afgeleverd op een sample pad en stroomt naar het startpunt, de blauwe en de rode latex deeltjes vangen pLDH en PfHRP2 antigenen, respectievelijk. De aan de latexdeeltjes gebonden antigenen worden vervolgens door de strook getransporteerd en worden gedetecteerd op de testlijn waar een mengsel van detectieantilichamen tegen (pan)pLDH en PfHRP2 gefunctionaliseerd wordt (Fig. 1). De verandering in de op het testgebied ontwikkelde kleurprofielen komt overeen met het aantal gevangen blauwe en rode latexdeeltjes.

de prestaties van de tweekleurige LFA werden eerst aangetoond door recombinant malariale antigenen te detecteren die in verschillende concentraties in de wasbuffer waren gepikeerd. Drie verschillende diagnostische scenario ‘ s werden getest: alleen pLDH, alleen PfHRP2 en gelijktijdige pldh-PfHRP2-infectie. Voor de co-detectie werden pLDH en PfHRP2 gemengd in een molaire verhouding van 1 tot 6, om klinische monsters van P. falciparum infectie na te bootsen . Vijftien minuten na dispensatie van het monster, gevolgd door bufferspoeling, werden de kleurprofielen op de testgebieden geregistreerd. Wanneer het monster alleen pLDH bevatte, werden blauwe testlijnen waargenomen (Fig. 2 bis). Bij de gelijktijdige detectie vertoonde het testgebied een mengkleur van blauw en rood (Fig. 2b). Alleen voor PfHRP2-monsters werden de testlijnen rood (Fig. 2c). De controlelijnen op alle LFA-strips vertoonden een mengkleur van blauw en rood, wat aangeeft dat zowel rode als blauwe latexdeeltjes door de strips werden getransporteerd.

Fig. 2
figure2

representatieve teststrips van de tweekleurige LFA. Bij de testlijnen werden verschillende kleuren waargenomen, die overeenkomen met een type antigenen, zoals een blauwe testlijnen voor alleen pLDH-detectie, B mengkleur van testlijnen voor gelijktijdige detectie en c rode testlijnen voor alleen PfHRP2-detectie. De mengkleur op controlelijnen gaf aan dat de rode en blauwe latexdeeltjes gemigreerd over de lengte van de strip

kenmerken in kleurprofielen van LFA-strips

om de kwantitatieve en kwalitatieve methode in de test toe te passen, werden de intensiteitsprofielen van de LFA-strips geanalyseerd. De beelden van de strips werden verkregen met behulp van een 8-megapixel achterwaarts gerichte camera van een iPad Air 2 onder dezelfde witte LED-lichtomstandigheden. De afstand tussen de testlijn en de regellijn was ongeveer 200 pixels, en de breedte van de lijn was ongeveer 50 pixels in de afbeeldingen. Om de RGB-kleurprofielen te verkrijgen, werden de afbeeldingen geopend met behulp van ImageJ-software en werd het commando “Color Profiler” uitgevoerd. Voor de eenvoud werden alleen de rode en blauwe intensiteitsprofielen geanalyseerd, aangezien de groene intensiteitsprofielen de rode en blauwe kleurdiscriminatie niet significant beïnvloedden en een extra waarde in kleurenbeelden opleverden. Het nitrocellulose membraan van de teststrip was wit, wat resulteerde in hoge achtergrond intensiteiten. De contrastkleuren bij de test-en regellijnen zorgden ervoor dat de pieken vervallen van de achtergrondintensiteit (Fig. 3).

Fig. 3
figure3

rode en blauwe intensiteitsprofielen van teststrips. RGB-kleurprofielen werden verkregen uit de stripafbeeldingen uit Fig. 2. Voor de eenvoud werden rode en blauwe intensiteiten weergegeven, behalve de groene intensiteit. a toen blauwe kleuren op de testlijnen verschenen, was de rode intensiteit meer vervallen dan de blauwe intensiteit. Deze trend was omdat de achtergrond van de witte strip hoge RGB-waarden behield. b Wanneer de kleur van het mengsel op de testlijnen verscheen, werden rode en blauwe pieken gegenereerd die overeenkomen met de concentratie van antigenen. c alleen voor PfHRP2-detectie waren de blauwe pieken meer vervallen dan rode pieken, in omgekeerde waarneming van a

werden twee intrigerende kenmerken in de kleurprofielen waargenomen. Ten eerste, toen de blauwe testlijnen op de strips verschenen, waren de rode intensiteitspieken meer vervallen dan de blauwe pieken in de kleurprofielen. Dit komt omdat de blauwe kleur relatief hogere blauwe pixelwaarden behield dan rode waarden. Figuur 3 toont de rode en blauwe intensiteitsprofielen van de strips uit afbeeldingen in Fig. 2. Voor pLDH-detectie alleen waar sterke blauwe testlijnen werden waargenomen, waren de rode intensiteiten significant vervallen van de bovenste achtergrond intensiteiten, meer dan blauwe pieken (Fig. 3a). In dezelfde context, PfHRP2 detectie met schijnbare rode testlijnen in de beelden gegenereerd de lagere blauwe pieken dan rode pieken (Fig. 3c).

het andere kenmerk in de kleurprofielen waren de niet-specifieke kleurpieken in Fig. 3a (blauwe intensiteit) en Fig. 3c (rode intensiteit) die niet geassocieerd werden met kleurontwikkeling door latexdeeltjes. Niet-specifieke binding of kruisreactiviteit op de testlijnen werd niet waargenomen met het blote oog. Inderdaad, Fig. 2 toonde een duidelijk onderscheid van kleuren voor elke detectiemodus. De niet-specifieke intensiteitspieken werden echter ontwikkeld door het beeldcontrast. Als latex deeltjes werden verzameld op de testlijnen, de duisternis nam toe, wat resulteert in afnemende RGB waarden. Dus alle intensiteit pieken in Fig. 3 waren niet van de zuivere kleuren, maar werden beïnvloed door beeldcontrast. Het was niet eenvoudig om het contrast en de zuivere kleur los te koppelen van beelden. Echter, een eenvoudige correlatiefunctie werd vastgesteld door de verhouding van de rode tot blauwe vervalgebieden te berekenen om het kleurtype te onderscheiden. Dit werd besproken en wordt besproken in de volgende paragraaf.

detectielimiet en grens van kleurverschil

om de stroken verder te analyseren, subjectiviteit te vermijden en de visuele detectielimiet te bevestigen, werden vervalgebieden van rode en blauwe pieken berekend uit Fig. 3. Om de piekgebieden te berekenen, werd de piekuitlijning eerst uitgevoerd op de achtergrondintensiteit. Simpson ‘ s 3/8 regel werd toegepast op de uitgelijnde pieken voor de numerieke integratie om gebieden te berekenen.

de resulterende grafieken in Fig. 4 toonde de gebieden van rode en blauwe pieken aan testlijnen als functie van antigeenconcentraties van drie onafhankelijke experimenten. Zowel rode als blauwe vervalgebieden namen toe met toenemende antigeenconcentraties. De mate van verval hangt echter af van het type Kleuren dat op de testlijnen wordt ontwikkeld. Voor pLDH alleen monsters, rode verval gebieden waren hoger dan blauwe (Fig. 4a), terwijl de PfHRP2 alleen monsters vertoonde de tegenovergestelde trend (Fig. 4c). Om de werkzaamheid van de assay te valideren, werd de detectielimiet (LoD) geschat door gebruik te maken van een standaardbenadering die is gedefinieerd als een gemiddelde plus driemaal de standaardafwijking (Snon-target + 3SD) van het signaal van het blanco monster. De LoD waarbij alle rode en blauwe signalen van de blanco monstersignalen konden worden onderscheiden, werd geschat op 31,2 ng mL-1 in alle detectiescenario ‘ s (ingevoegde cijfers in Fig. 4).

Fig. 4
figure4

berekening van rode en blauwe vervalgebieden op de testlijnen. De rode en blauwe vervalgebieden werden berekend uit Fig. 3 alleen voor een pLDH-detectie, B gelijktijdige pldh-en PfHRP2-detectie en c PfHRP2-detectie. De verschillende graden van vervalgebieden tussen de rode en blauwe intensiteiten werden waargenomen als functie van steekproeftypes en concentraties. De ingevoegde grafieken werden bij lagere concentraties ingezoomd. De LoD om te onderscheiden van niet-doelmonsters was 31,2 ng mL-1 voor alle detectiemodi. Foutbalken geven standaardafwijkingen aan van triplicaatexperimenten

vervolgens werd de verhouding van vervalgebieden van het rood naar blauw berekend om een eenvoudige methode van kleurdiscriminatie te bieden (Fig. 5). Zoals verwacht namen de vervalratio ‘ s toe met toenemende pLDH-concentraties die rode kleurintensiteiten toekenden (bovenste curve in Fig. 5). Het gebied boven de bovenste blauwe curve is de pLDH enige regio, wat wijst op P. falciparum negatief.

Fig. 5
figure5

verhoudingen van rode naar blauwe vervalgebieden. De eenvoudige functie van de kleurverhoudingen berekend uit Fig. 4 een criterium verstrekt om kleuren te onderscheiden in functie van de monsterconcentraties. De blauwe curve met cirkelmakers was boven de andere curves, wat wijst op sterke blauwe kleuren. Voor de blauwe kromme werden pLDH-concentraties in de x-as getoond. De middelste kromme met diamantmarkeringen was een tussenliggende kromme tussen boven-en onderkrommen, en vertegenwoordigde de mengkleuren rood en blauw. Voor de middelste kromme werden PfHRP2-concentraties in de x-as getoond en werd pLDH/PfHRP2 gemengd in de verhouding 1:6. De onderste curve gaf de sterke rode kleuren aan. Voor de rode kromme werden PfHRP2 concentraties in de x-as getoond. De pijlen in de ingevoegde grafiek toonden de grens van het kleurverschil waaruit de blauwe kleuren van de rode kleuren konden worden onderscheiden. Foutbalken zijn standaarddeviaties van triplicaatexperimenten

daarentegen namen De ratio-waarden af bij toenemende PfHRP2-concentraties (onderste curve in Fig. 5). Het gebied onder de onderste rode kromme bevat alleen PfHRP2. Aangezien pLDH pan-specifiek is, moet het altijd aanwezig zijn bij malaria-positieve gevallen. Voor alle vier menselijke malariasoorten zal het resultaat niet in het PfHRP2-gebied vallen.

De vervalratio ‘ s in de gelijktijdige detectie waren intermediair en opgenomen tussen de bovenste en de onderste curve in Fig. 5, wat aangeeft dat het een mengkleur van blauw en rood moet zijn. Het gebied tussen de bovenste blauwe kromme en de onderste rode kromme bevat zowel pLDH als PfHRP2, wat wijst op P. falciparum positief.

de grens van het kleurverschil waarbij de rode en blauwe kleuren met dezelfde definitie van LoD konden worden onderscheiden, werd geschat. Het kan worden waargenomen dat de bovenste kromme in Fig. 5 was altijd hoger dan de waarden plus 3SD van de onderste curve na 7,8 mg mL-1, ingesteld als de grens van kleurverschil (ingevoegd figuur in Fig. 5).

validatie van tweekleurige LFA door het testen van klinische monsters

voor de 15 geteste negatieve monsters liggen de kleurintensiteit onder de LoD voor zowel pLDH als PfHRP2 en worden daarom als malarianegatief beschouwd. Om infectietypen te onderscheiden en antigeenconcentraties te schatten voor de 10 malariapositieve monsters, werd kleurdiscriminatie uitgevoerd met de RGB-waarden van ImageJ-analyse. Aangezien pLDH pan-specifiek is en zich bindt aan alle malariasoorten, kan de aanwezigheid van pLDH worden verwacht in alle malariapositieve monsters. De pLDH-concentratie kan worden geschat door de overeenkomstige rode vervalgebieden met de kalibratiekromme in Fig. 4. Voor alle positieve steekproeven van malaria, werd een vier-stap trial and error methode goedgekeurd om te bepalen of de steekproef P. falciparum of niet-P. falciparum (d.w.z., P. vivax, P. ovale, of P. malariae).

  • Stap 1: ImageJ wordt gebruikt voor de berekening van de rode en blauwe vervalgebieden voor de testlijn, waarna de verhouding van de rode en blauwe vervalgebieden werd berekend en gedefinieerd als ratio_cal.

  • Stap 2: aangezien pLDH aanwezig is in alle positieve klinische monsters, neem aan dat het monster alleen pLDH bevat en correleer de in Stap 1 gemeten rode vervalgebieden met pldh-concentraties, met de kalibratiekromme in Fig. 4a.

  • Stap 3: Zoek de waarde van de verhouding tussen rode en blauwe vervalgebieden (y-as) op de bovenste blauwe curve in Fig. 5 bij de berekende pldh-concentratie (uit Stap 2), en definieer deze als ratio_ref.

  • Stap 4: bestaat uit twee scenario ‘ s: (1) als ratio_cal ≥ ratio_ref, valt het monster in het gebied boven de bovenste blauwe curve in Fig. 5 (pLDH enige regio), wat wijst op niet-P. falciparum, maar malaria positief (P. vivax, P. ovale, of P. malariae). In dit scenario zijn de geschatte pLDH-concentraties van Stap 2 geldig omdat de monsters alleen pLDH bevatten; (2) Indien ratio_cal < ratio_ref, valt het monster in het gebied tussen de bovenste blauwe curve en de onderste rode curve in Fig. 5 (pldh + PfHRP2-gebied), wat wijst op P. falciparum-positief. In dit scenario zijn de geschatte pLDH-concentraties uit Stap 2 niet geldig omdat de monsters pLDH en PfHRP2 bevatten en de kalibratiekromme in Fig. 4a kan niet worden toegepast. De interpretatie van mengkleur was ingewikkeld, en mogelijk bevooroordeeld door beeldcontrast. Het was ook niet eenvoudig om standaardcurves te maken die elk scenario van kleurencombinaties kunnen dekken.

De rode en blauwe vervalgebieden en kleurverhoudingen van de P. falciparum positieve en P. vivax positieve monsters werden weergegeven in respectievelijk Tabel 1 en 2.

Tabel 1 Resultaten van image analysis, en de schatting van het antigeen concentratie en type van malaria infectie door Plasmodium falciparum positieve klinische monsters
Tabel 2 Resultaten van beeldanalyse, en de schatting van het antigeen concentratie en type van malaria infectie door Plasmodium vivax klinische monsters

Zoals weergegeven in Tabel 1, de 5 monsters werden bevestigd als P. falciparum positieve microscopie onderzoek. Met behulp van de hierboven getoonde vierstaps trial and error-methode werd de rood-blauwreferentieverhouding (ratio_ref) geschat op het overeenkomstige rode vervalgebied door de pldh-kalibratiekrommen en vergeleken met de rood-blauwverhouding van klinische monsters (ratio_cal). Aangezien ratio_cal < ratio_ref voor alle 5 in Tabel 1 vermelde monsters vallen alle monsters in scenario 2 in Stap 4 zoals hierboven beschreven. Dan zou men kunnen concluderen dat de steekproef positief P. falciparum is. Bijvoorbeeld, wordt steekproef No. 25 bevestigd als P. falciparum positief door microscopie. Het Rode vervalgebied en het blauwe vervalgebied op de testlijn zijn respectievelijk 917.11 en 499.20. De rood-blauwverhouding van monster nr. 25 (ratio_cal) bedraagt derhalve 1,84. De rood-blauwe referentieverhouding bij het overeenkomstige rode vervalgebied (917.11) (ratio_ref) wordt berekend door de pldh-kalibratiekromme in Fig. 4a, en de waarde is 1,95. Aangezien 1,95 (ratio_ref) > 1,84 (ratio_cal), dan Monster nr. 25 wordt bevestigd als P. falciparum positief door LFA kleurdiscriminatie. Dit stemt met zowel microscopie als ELISA resultaten overeen.

zoals getoond in Tabel 2, werden de 5 monsters bevestigd als P. vivax positief door microscopie onderzoek. Evenzo werden ratio_ref en ratio_cal verkregen. Aangezien ratio_cal > ratio_ref voor alle 5 in Tabel 2 vermelde monsters vallen alle monsters in de pLDH enige regio, wat wijst op malaria positief maar negatief voor P. falciparum. In dit geval de pldh-kalibratiekromme in Fig. 4a kan worden toegepast om de pLDH-concentraties voor alle monsters in Tabel 2 te verkrijgen. Bijvoorbeeld, wordt steekproef nr 471 bevestigd als P. vivax positief door microscopie. Het Rode vervalgebied en het blauwe vervalgebied op de testlijn zijn respectievelijk 631.10 en 299.22. De rood-blauwverhouding van monster nr. 471 (ratio_cal) bedraagt derhalve 2,11. De rood-blauwe referentieverhouding bij het overeenkomstige rode vervalgebied (631.10) (ratio_ref) wordt berekend door de pldh-kalibratiekromme in Fig. 4a, en de waarde is 1,63. Aangezien 2.11 (ratio_cal) > 1,63 (ratio_ ref), dan Monster nr. 471 wordt bevestigd als malaria positief, maar P. falciparum negatief door LFA kleurdiscriminatie. Dit stemt met zowel microscopie als ELISA resultaten overeen.

voor alle monsters in Tabel 2 moet worden opgemerkt dat de resultaten van de pldh-kwantificering discordantie vertoonden tussen de LFA-en ELISA-methoden. De geschatte concentratie in LFA was lager dan die van ELISA. Deze fout kan worden toegeschreven aan het verschil in standaardcurves voor klinische buffer-en volbloedmonsters . Voor monster Nr. 486 moet ook worden opgemerkt dat de PfHRP2−concentraties met LFA-en ELISA-methoden respectievelijk 0 en 3,35 ng mL-1 zijn, aangezien 3,35 ng mL-1 reeds boven de LoD van LFA voor PfHRP2-detectie ligt.

Geef een antwoord

Het e-mailadres wordt niet gepubliceerd.