Rask Oksidasjon av Cystein Til Cystin I Vandige Løsninger – Implikasjoner for Brukt Medieanalyse

Last ned dette notatet (PDF)

Cystein oksidasjon i cellekulturmedier

Cellekulturmedier gir vanligvis alle aminosyrene som er nødvendige for at cellene skal vokse. Begrensninger i en eller flere aminosyrer resulterer ikke bare i suboptimal vekst av cellekulturer, men påvirker også produktutbytte og kvalitet negativt. Under prosessutvikling bidrar brukt medieanalyse til å overvåke aminosyrekonsentrasjoner og bestemme forbrukshastigheter for å oppdage og unngå slike begrensninger.Dette er spesielt utfordrende i tilfelle cystein, da det lett blir oksidert for å danne cystin, en dimer av to cysteinmolekyler, koblet via en disulfidbro. Nylig rapporterte et papir dedikert til temperatur og lagringsstabilitet av cellekulturmedier også aminosyren cystein å være spesielt ustabil under de testede forholdene (Krattenmacher et al ., 2018). Dette er i samsvar med vår erfaring, da vi ofte måler ingen eller bare spor av cystein, mens cystin-dets oksiderte form-er tydelig oppdaget. Vi gjennomførte eksperimenter som undersøkte redoksadferden til cystein og cystin i vann, med tanke på at de mer komplekse forholdene som finnes i (brukte) cellekulturmedier, kan lette mer kompleks kjemi.

Interkonvertering av cystein til cystin i vann

for å lære mer om cystein (in-)stabilitet forberedte vi en 1 mM løsning i vann, lagret den ved romtemperatur og tok prøver på forskjellige tidspunkter. Vi tok flere prøver i løpet av 26 timer og deretter en» langsiktig » prøve etter 6 dager. Hver prøve ble derivatisert direkte etter prøvetaking og målt ved hjelp av vår proprietære aminosyreanalysegradient på Et Agilent 1290 UHPLC-DAD-system. En løsning på 0,5 mM cystin ble behandlet på samme måte og fungerte som en kontroll.

som vist I Tabell 1 Og Figur 1, inneholdt selv en prøve av en nylaget cysteinoppløsning (0 timer) detekterbare mengder cystin. Allerede 11% av aminosyren var opprinnelig tilstede i form av dimer. Denne verdien var ganske stabil i de første timene, muligens fordi cystein allerede inneholdt noe cystin før oppløselighet. Etter 24 timer hadde mer cystein skiftet mot cystin, noe som resulterte i 65% cystein og 35% cystin. Etter 6 dager ble 98% av cystein omdannet til cystin (Figur 2).

i motsetning til cystein viste cystin seg å være stabil i oppløsning. Konsentrasjonen holdt seg konstant og ingen cystein kunne påvises i noen av kontrollprøvene (Se Tabell 2, Figur 1 + 2).

i tillegg til målingene beskrevet ovenfor ble alikvoter av cystein-og cystinoppløsningene behandlet MED dtt (dithiothreitol) eller TCEP(tris (2-karboksyetyl)fosfin), to vanlige reduksjonsmidler. Som vist i Tabell 3 til 6, beskyttet begge reagensene cystein fra oksidasjon til cystin, og reduserte til og med cystin til å frigjøre cystein nesten helt. Reduserende effekter AV TCEP var sterkere sammenlignet med DTT.

Konklusjon

Cystein er en vanlig bestanddel av cellekulturmedier, men oppdages ofte ikke i prøver av brukte medier på grunn av ustabilitet i vandige løsninger. Forsøket beskrevet i dette notatet viser at cystein hovedsakelig oksyderes for å danne cystin. Oksidasjonen av cystein til cystin innebærer også at cystein og cystin ikke bør inkluderes i samme standardblanding. I stedet kan individuelle standarder for cystein fremstilles og beskyttes mot oksidasjon ved BRUK AV TCEP.Videre observert vi oksidasjonen av cystein for å fortsette enda raskere i cellekulturmedier spiked med ekstra cystein (data ikke vist). Dette må vurderes når potensielle aminosyrebegrensninger blir analysert ved brukt medieanalyse. Derfor er det viktig å ha passende kvantitasjonsmetoder på plass.Inkludert cystein og cystin gir vår metode for aminosyreanalyse kvantitative resultater for alle proteinogene aminosyrer samt for etanolamin, citrullin, hydroksyprolin, ornitin og taurin. Kontakt oss for å be om mer informasjon og teste den.

Rask og pålitelig aminosyreanalyse

Tabeller og Figurer

Tab. 1

Kategorien. 1: Relative mengder (rel. Amt.) av cystein og cystin i nylaget 1 mM cystein i vann, målt VED UHPLC-DAD etter derivatisering. Prøvetaking tid vises i timer / dager etter tilberedning.

Kategorien. 2

Kategorien. 2: Relative mengder (rel. Amt.) av cystein og cystin i nylaget 0,5 mM cystin i vann, målt VED UHPLC-DAD etter derivatisering. Prøvetaking tid vises i timer / dager etter tilberedning.

Kategorien. 3

Kategorien. 3: Relative mengder (rel. Amt.) av cystein og cystin i nylaget 1 mM cystein pluss 0,5 mM DTT i vann, målt VED UHPLC-DAD etter derivatisering. Prøvetaking tid vises i timer / dager etter tilberedning.

Kategorien. 4

Kategorien.4: Relative mengder (rel. Amt.) av cystein og cystin i nylaget 1 mM cystein pluss 0,5 mM TCEP i vann, målt VED UHPLC-DAD etter derivatisering. Prøvetaking tid vises i timer / dager etter tilberedning.

Kategorien. 5

Kategorien.5: Relative mengder (rel. Amt.) av cystein og cystin i nylaget 0,5 mM cystin pluss 0,5 mM DTT i vann, målt VED UHPLC-DAD etter derivatisering. Prøvetaking tid vises i timer / dager etter tilberedning.

Kategorien. 6

Kategorien.6: Relative mengder (rel. Amt.) av cystein og cystin i nylaget 0,5 mM cystin pluss 0,5 mM TCEP i vann, målt VED UHPLC-DAD etter derivatisering. Prøvetaking tid vises i timer / dager etter tilberedning.

Fig. 1

Fig. 1: Cystein / cystin målinger 0h etter utarbeidelse av løsningene. Den første ruten viser målinger uten reduksjonsmiddel, den andre ruten dtt reduksjon og den tredje ruten TCEP reduksjon. Vises ER UHPLC-DAD kromatogrammer med fokus på cystein og cystin topper målt etter derivatisering.

Fig. 2

Fig. 2: Cystein / cystin målinger 6d etter tilberedning av løsningene. Den første ruten viser målinger uten reduksjonsmiddel, den andre ruten dtt reduksjon og den tredje ruten TCEP reduksjon. Vises ER UHPLC-DAD kromatogrammer med fokus på cystein og cystin topper målt etter derivatisering.

Legg igjen en kommentar

Din e-postadresse vil ikke bli publisert.