et tofarget multiplexet lateral flow immunoassay system for differensielt å oppdage humane malariaarter på en enkelt testlinje

Prinsipp for tofarget LFA i multiplexet deteksjon av malariaantigener på en enkelt testlinje av LFA-stripen

i LFA, når prøvevæsken dispenseres på en prøvepute og strømmer til konjugatet.pad, de blå og røde latexpartiklene fanger henholdsvis pldh og pfhrp2 antigener. Antigenene bundet til latekspartiklene transporteres deretter gjennom stripen, og oppdages ved testlinjen der en blanding av deteksjonsantistoffer mot (pan)pLDH og PfHRP2 er funksjonalisert (Fig. 1). Endringen i fargeprofilene som er utviklet i testområdet, tilsvarer antallet av de fangede blå og røde latexpartiklene.

ytelsen for tofarget LFA ble først demonstrert ved å oppdage rekombinante malarial antigener spiked i vaskebufferen ved forskjellige konsentrasjoner. Tre forskjellige diagnosescenarier ble testet: kun pLDH, Kun PfHRP2 og samtidig pldh-PfHRP2-infeksjon. For samtidig deteksjon ble pLDH og PfHRP2 blandet i et molarforhold på 1 til 6, for å etterligne kliniske prøver Av p. falciparum-infeksjon . Femten minutter etter prøveutdeling etterfulgt av buffervask ble fargeprofilene på testområdene registrert. Når prøven bare inneholdt pLDH, ble det observert blå testlinjer (Fig. 2a). Ved samtidig deteksjon viste testområdet en blandingsfarge på blått og rødt (Fig. 2b). For PfHRP2 bare prøver ble testlinjene røde (Fig. 2c). Kontrolllinjene på ALLE lfa-stripene viste en blandingsfarge på blått og rødt, noe som indikerer at både røde og blå latexpartikler ble transportert gjennom stripene.

Fig. 2
figure2

Representative teststrimler av tofarget LFA. Distinkte farger ble observert ved testlinjene, tilsvarende en type antigener, slik som blå testlinjer for pLDH-deteksjon, b-blandingsfarge for testlinjer for samtidig deteksjon, og c-røde testlinjer for PfHRP2-deteksjon. Blandingsfargen på kontrolllinjene indikerte at de røde og blå latekspartiklene migrerte langs stripens lengde

Funksjoner i fargeprofiler av LFA-striper

for å implementere den kvantitative og kvalitative metoden i analysen ble intensitetsprofilene til LFA-stripene analysert. Bildene av stripene ble kjøpt ved hjelp av et 8 megapiksel bakovervendt kamera av en iPad Air 2 under de samme hvite LED-lysforholdene. Avstanden mellom testlinjen og kontrolllinjen var omtrent 200 piksler, og bredden på linjen var omtrent 50 piksler i bildene. For Å få RGB-fargeprofilene ble bildene åpnet ved Hjelp Av ImageJ-programvare og utført «Color Profiler» – kommandoen. For enkelhets skyld ble bare de røde og blå intensitetsprofilene analysert, siden grønne intensitetsprofiler ikke signifikant påvirket den røde og blå fargediskrimineringen, og ga en tilleggsverdi i fargebilder. Nitrocellulosemembranen i teststrimmelen var hvit, noe som resulterte i høye bakgrunnsintensiteter. Fargene med kontrast på test-og kontrolllinjene genererte toppene forfalt fra bakgrunnsintensitetene (Fig. 3).

Fig. 3
figure3

røde og blå intensitetsprofiler av teststrimler. RGB fargeprofiler ble hentet fra stripe bilder Fra Fig. 2. For enkelhet ble røde og blå intensiteter representert, bortsett fra den grønne intensiteten. a når blå farger dukket opp på testlinjene, rød intensitet var mer forfalt enn blå intensitet. Denne trenden var fordi bakgrunnen til den hvite stripen beholdt høye rgb-verdier. b når blandingsfargen dukket opp på testlinjene, ble røde og blå topper generert tilsvarende konsentrasjonen av antigener. c for PfHRP2-deteksjon var de blå toppene mer forfalt enn røde topper, i omvendt observasjon fra a

To spennende funksjoner i fargeprofilene ble observert. Først da de blå testlinjene dukket opp på stripene, var de røde intensitetstoppene mer forfalt enn blå topper i fargeprofilene. Dette skyldes at den blå fargen beholdt relativt høyere blå pikselverdier enn røde verdier. Figur 3 viser de røde og blå intensitetsprofilene til stripene hentet fra bilder I Fig. 2. For pLDH-deteksjon bare der sterke blå testlinjer ble observert, ble de røde intensitetene signifikant forfallet fra topp bakgrunnsintensiteter, mer enn blå topper (Fig. 3a). I samme sammenheng genererte PfHRP2-deteksjon med tilsynelatende røde testlinjer i bildene de nedre blå toppene enn røde topper(Fig . 3c).

den andre funksjonen i fargeprofilene var de ikke-spesifikke fargetoppene I Fig. 3a (blå intensitet) Og Fig. 3c (rød intensitet) som ikke var assosiert med fargeutvikling av latekspartikler. Ikke-spesifikk binding eller kryssreaktivitet på testlinjene ble ikke observert med blotte øyne. Faktisk, Fig. 2 viste tydelig forskjell på farger for hver deteksjonsmodus. Imidlertid ble de ikke-spesifikke intensitetstoppene utviklet av bildekontrast. Da latexpartikler ble akkumulert ved testlinjene, økte mørket, noe som resulterte i avtagende rgb-verdier. Dermed topper all intensitet I Fig. 3 var ikke fra de rene fargene, men ble påvirket av bildekontrast. Det var ikke lett å koble kontrasten og ren farge fra bilder. Imidlertid ble en enkel korrelasjonsfunksjon etablert ved å beregne forholdet mellom de røde og blå forfallsområdene for å diskriminere fargetypen. Dette ble behandlet og diskutert i neste avsnitt.

grense for deteksjon og grense for fargeforskjell

for å analysere stripene ytterligere, unngå subjektivitet og bekrefte visuell grense for deteksjon, ble forfallsområder av røde og blå topper beregnet Fra Fig. 3. For å beregne toppområdene ble toppjustering først utført på bakgrunnsintensiteten. Og Så Ble Simpsons 3/8-regel brukt på de justerte toppene for numerisk integrasjon for å beregne områder.

de resulterende grafene I Fig. 4 viste områdene av røde og blå topper ved testlinjer som en funksjon av antigenkonsentrasjoner fra tre uavhengige eksperimenter. Både røde og blå henfallsområder økte med økende antigenkonsentrasjoner. Graden av henfallsområder avhenger imidlertid av hvilken type farger som er utviklet på testlinjene. For pLDH bare prøver var røde forfallsområder høyere enn blå (Fig. 4a), mens PfHRP2 bare prøver viste motsatt trend(Fig. 4c). For å validere effekten av analysen ble deteksjonsgrensen (lod) estimert ved å vedta en standard tilnærming definert som et gjennomsnitt pluss tre ganger standardavviket (Snon-target + 3SD) for det tomme prøvesignalet. LoD hvor alle røde og blå signaler ble skilt fra de tomme prøvesignalene ble estimert til å være 31,2 ng mL-1 i alle deteksjonsscenarier (innsatte tall I Fig. 4).

Fig. 4
figure4

Beregning av røde og blå forfallsområder på testlinjene. De røde og blå forfallsområdene ble beregnet Ut Fra Fig. 3 kun for pLDH-deteksjon, b samtidig pldh-og PfHRP2-deteksjon og C PfHRP2-deteksjon. De ulike grader av forfall områder mellom de røde og blå intensiteter ble observert som en funksjon av prøvetyper og konsentrasjoner. De innsatte grafene ble zoomet inn ved lavere konsentrasjoner. LoD for å skille fra ikke – målprøver var 31.2 ng mL-1 for alle deteksjonsmoduser. Feilfelt angir standardavvik fra tredobbelte eksperimenter

deretter ble forholdet mellom forfallsområder av rødt til blått beregnet for å gi en enkel metode for fargediskriminering (Fig. 5). Som forventet økte forfallsforholdene med økende pLDH-konsentrasjoner som tilskrives røde fargeintensiteter (toppkurve I Fig. 5). Regionen over den øverste blå kurven er den eneste pldh-regionen, noe Som indikerer P. falciparum negativ.

Fig. 5
figure5

Forhold mellom røde til blå områder med forfall. Den enkle funksjonen til fargeforholdene beregnet Fra Fig. 4 gitt et kriterium for å diskriminere farger som en funksjon av prøvekonsentrasjoner. Den blå kurven med sirkelmakere var over de andre kurvene, noe som indikerer sterke blå farger. For den blå kurven ble pldh-konsentrasjoner vist i x-aksen. Midtkurven med diamantmarkører var en mellomliggende kurve mellom topp-og bunnkurver, og representerte blandingsfargene rød og blå. For midtkurven ble PfHRP2-konsentrasjoner vist i x-aksen, og pLDH / PfHRP2 ble blandet i forholdet 1: 6. Den nederste kurven indikerte de sterke røde fargene. For den røde kurven ble PfHRP2-konsentrasjoner vist i x-aksen. Pilene i den innsatte grafen viste grensen for fargeforskjellen som de blå fargene ble skilt fra de røde fargene. Feilstenger er standardavvik fra tredobbelte eksperimenter

i kontrast ble forholdsverdiene redusert med økende PfHRP2-konsentrasjoner (bunnkurve I Fig. 5). Regionen under den nederste røde kurven inneholder Bare PfHRP2. Siden pLDH er pan-spesifikk, bør det alltid være til stede for malaria positive tilfeller. For alle fire humane malariaarter vil resultatet ikke falle inn I PfHRP2 – regionen.

forfallsforholdene i den samtidige deteksjonen var mellomliggende og inkludert i mellom toppkurven og bunnkurven I Fig. 5, indikerer det bør være en blanding farge av blått og rødt. Området mellom den øverste blå kurven og den nederste røde kurven inneholder både pLDH og PfHRP2, noe Som indikerer P. falciparum positiv.

grensen for fargeforskjellen der de røde og blå fargene ble skilt ved hjelp av samme definisjon Av LoD ble estimert. Det kan observeres at toppkurven I Fig. 5 var alltid høyere enn verdiene pluss 3sd av bunnkurven etter 7,8 mg mL-1, satt som grense for fargeforskjell (satt inn figur I Fig. 5).

Validering av tofarget LFA ved å teste kliniske prøver

for de 15 negative prøvene som ble testet, er fargeintensiteten under LoD for både pLDH og PfHRP2 og anses derfor som malarianegativ. For å skille mellom infeksjonstyper og estimere antigenkonsentrasjoner for de 10 malariapositive prøvene ble fargediskriminering utført med Rgb-verdiene Fra ImageJ-analysen. Siden pLDH er pan-spesifikk og bindes til alle malariaarter, kan tilstedeværelse av pLDH forventes i alle malariapositive prøver. PLDH-konsentrasjonen kan estimeres med tilhørende røde henfallsområder med kalibreringskurven I Fig. 4. For alle malariapositive prøver ble en fire-trinns prøve-og feilmetode vedtatt for å avgjøre om prøven Er P. falciparum eller ikke-p. falciparum (dvs. P. vivax, P. ovale, Eller P. malariae).Trinn 1: ImageJ brukes til å beregne de røde og blå forfallsområdene for testlinjen, da ble forholdet mellom røde og blå forfallsområder beregnet og definert som forhold_cal.

  • Trinn 2: siden pLDH er tilstede i alle positive kliniske prøver, anta at prøven bare inneholder pLDH og korrelerer de røde nedbrytningsområdene målt I Trinn 1 med pLDH-konsentrasjoner, med kalibreringskurven I Fig. 4a.

  • Trinn 3: Finn verdien av forholdet mellom røde og blå henfallsområder (y-akse) på den øverste blå kurven I Fig. 5 ved den beregnede pldh-konsentrasjonen (Fra Trinn 2), og definer den som ratio_ref.

  • Trinn 4: vil bestå av to scenarier: (1) hvis forhold_cal ≥ forhold_ref, faller prøven inn i området over den øverste blå kurven I Fig. 5 (pLDH eneste region), som indikerer ikke-p. falciparum, men malaria positiv(P. vivax, P. ovale eller p. malariae). I dette scenariet er de estimerte pldh-konsentrasjonene Fra Trinn 2 gyldige siden prøvene bare inneholder pLDH; (2) hvis ratio_cal < ratio_ref, faller prøven inn i området mellom den øverste blå kurven og den nederste røde kurven I Fig. 5 (pLDH + PfHRP2 region), som indikerer P. falciparum positiv. I dette scenariet er de estimerte pldh-konsentrasjonene Fra Trinn 2 ikke gyldige siden prøvene inneholder pLDH og PfHRP2 og kalibreringskurven I Fig. 4a kan ikke benyttes. Tolkningen av blandingsfarge var komplisert, og muligens partisk av bildekontrast. Det var heller ikke lett å lage standardkurver som kan dekke alle scenarier av fargekombinasjoner.

  • de røde og blå nedbrytningsområdene og fargeforholdene i p. falciparum-positive og p. vivax-positive prøvene ble presentert i Henholdsvis Tabell 1, 2.

    Tabell 1 Resultater av bildeanalyse, og estimering av antigenkonsentrasjoner og type malariainfeksjon fra Plasmodium falciparum positive kliniske prøver
    tabell 2 resultater av bildeanalyse, og estimering av antigenkonsentrasjoner og type malariainfeksjon fra plasmodium vivax kliniske prøver

    som vist i tabell 1 ble de 5 prøvene bekreftet som p. falciparum positive ved mikroskopiundersøkelse. Ved hjelp av den fire-trinns prøve – og feilmetoden som er illustrert ovenfor, ble det røde til blå referanseforholdet (ratio_ref) estimert til det tilsvarende røde henfallsområdet ved pldh-kalibreringskurvene og sammenlignet med det røde til blå forholdet mellom kliniske prøver (ratio_cal). Siden ratio_cal< ratio_ref for alle de 5 prøvene som er oppført I Tabell 1, faller alle prøvene inn i scenario to I Trinn 4 som beskrevet ovenfor. Da kan det konkluderes med At prøven Er p. falciparum positiv. 25 bekreftet Som p. falciparum positiv ved mikroskopi. Det røde forfallsområdet og det blå forfallsområdet på testlinjen er henholdsvis 917,11 og 499,20. 25 (ratio_cal) er derfor 1,84. Det røde til blå referanseforholdet ved det tilsvarende røde forfallsområdet (917.11) (ratio_ref) beregnes av pLDH-kalibreringskurven I Fig. 4a, og verdien er 1,95. Siden 1.95 (ratio_ref) > 1.84 (ratio_cal), er prøve nr. 25 bekreftet som p. falciparum positiv VED lfa fargediskriminering. Dette stemmer med både mikroskopi og ELISA resultater.

    som vist i Tabell 2 ble de 5 prøvene bekreftet Som P. vivax positiv ved mikroskopi undersøkelse. Tilsvarende ble ratio_ref og ratio_cal oppnådd. Siden ratio_cal > ratio_ref for alle de 5 prøvene som er oppført I Tabell 2, faller alle prøvene inn i pLDH – regionen, noe som indikerer malaria positiv, men negativ For P. falciparum. I dette tilfellet er pLDH kalibreringskurven I Fig. 4a kan brukes for å få pldh-konsentrasjonene for alle prøvene I Tabell 2. 471 bekreftet Som p. vivax positiv ved mikroskopi. Det røde forfallsområdet og det blå forfallsområdet på testlinjen er henholdsvis 631,10 og 299,22. 471 (ratio_cal) er derfor 2.11. Det røde til blå referanseforholdet ved det tilsvarende røde forfallsområdet (631.10) (ratio_ref) beregnes av pLDH-kalibreringskurven I Fig. 4a, og verdien er 1,63. Siden 2.11 (ratio_cal) > 1.63 (ratio_ ref), er prøve nr. 471 bekreftet som malaria positiv, Men P. falciparum negativ ved lfa fargediskriminering. Dette stemmer med både mikroskopi og ELISA resultater.

    for alle prøvene I Tabell 2 skal det bemerkes at pldh-kvantifiseringsresultatene viste uenighet mellom lfa-og ELISA-metodene. Den estimerte konsentrasjonen i LFA var lavere enn FOR ELISA. Denne feilen kan tilskrives forskjellen i standardkurver for buffer og fullblod klinisk prøve . 486, PfHRP2 konsentrasjoner MED LFA og ELISA metoder er henholdsvis 0 og 3,35 ng mL−1, siden 3,35 ng mL-1 allerede er utenfor LoD AV LFA For PfHRP2 deteksjon.

    Legg igjen en kommentar

    Din e-postadresse vil ikke bli publisert.