組織学のための固定への紹介:あなたが修正する前に考えてみてください!

多くの細胞または組織ベースの実験のために、組織学顕微鏡は、エンドポイントである可能性が高い、と記事のこのシリーズでは、我々は、組織や細胞の収集、固定と処理、その後の染色、顕微鏡イメージングと分析に関するいくつかの結合アップ思考がより良い結果を生成する方法を説明したいと思います。

イメージングを容易にする

例えば、強いよく染色された蛍光細胞または組織は、広視野、共焦点または超解像顕微鏡を使用しているかどうか 適切な検出系および適切に固定された細胞または組織を使用することにより、良好な染色が達成される。

固定の目的

固定の目的は、できるだけ生命のような状態に近い細胞または組織を保存し、自己分解および腐敗を防止し、その後の処理から組織を保護することである。 固定剤は、例えば、異なるアクションを持っています。 架橋結合、沈殿性、coagulative等。 彼らはまた、通常、時間あたりのmmごとに浸透深さで測定された異なる浸透率を持っています。 私は通常、組織への固定剤の体積の20倍に固定し、一貫した時間のために固定することをお勧めします-例えば、私は通常、中性緩衝ホルマリンで24時間、またはブイン液で6時間、少なくとも一つの寸法で厚さ0.5cmのサンプルを固定します。 私は処理する前に70%のエタノール(多くの定期的なパラフィンの処理の議定書の第一段階)にそれからサンプルを移します。どの温度ですか?

どの温度ですか?

温度も考慮されます-低温は組織の自己分解を減らしますが、浸透速度が遅くなりますので、あなたにとって重要なものを選択してください。

私は通常、樹脂に加工される組織や低温固定が推奨されるいくつかの敏感な抗原を除いて、室温で固定します。

選択は終わりに依存します

固定剤の選択は、エンドポイントによって決定されます-例えば、樹脂切片の光または電子顕微鏡検査に非常に高度な形態学的保存が必要な場合、グルターアルデヒドベースの固定剤(おそらくパラホルムアルデヒドと組み合わせて)が選択される可能性があります。 これらのいずれも脂質を保存するのに有効ではないので(それはその後の樹脂またはプラスチックへの処理で失われるであろう)、組織は四酸化オスミウムで後固定される必要があるであろう。

グルタルアルデヒドについて一言

グルタルアルデヒドはゆっくりと組織に浸透するので、組織片ははるかに小さくするか、固定 しかし、人生の多くのものと同様に、この高度な形態学的保存を得るためのトレードオフがあります-一般的に、経験的染色技術(ヘマトキシリンやエオシン、PASなど)を実行することははるかに困難です。)または抗体を用いた分子組織プロービング技術(免疫組織化学など。)または核酸プローブ(in-situハイブリダイゼーション)など。Brrr-クライオスタットの冷たい世界!

スケールのもう一方の端は、固定なしまたは最小限の凍結(またはクライオスタット)セクションを使用することです。 例えば、凍結されたセクションはスライドに空気乾燥させ、直接汚される作り出されたである場合もあります。 従って、それに固定剤の化学露出がまたはパラフィンの処理と関連付けられるアルコール、溶媒および熱ありませんでした。 ある特定の技術のためにこれにある特定の抗原と優秀な結果を与えることができる頭脳のティッシュのための脂質、immunohistochemistryおよびimmunofluorescenceの巨大な利点の例えば しかし、他の組織のために得られた一般的に貧しい形態は、全体的にこれをあまり主流にしません。私たちの政治家のように、私たちのほとんどは中間地点にアピールしようとします!

政治的固定

私たちの政治家のように、私たちのほとん 当分の間,固定の中間地点はホルマリン固定パラフィン包埋組織である。 それは診断病理学で広く使用されます-病理学者はこのように固定されるティッシュのクロマチンパターンをよく知られて、蛋白質がよく保存されるように形態学的保存および化学保存のよい程度を提供します、頻繁にマスクされるが(元に戻すことができる)およびmRNAおよびDNAはまたハイブリダイゼーションすることができます。

異なる分野、異なる好み

抗体メーカーは、おそらくこの容易に入手可能なタイプのサンプルでこれらの試薬を最適化し、検証したため、FFPE組織 しかし、政党のように、異なる分野は異なる好みを持っています! 例えば、私たちの研究センターの一つでマクロファージを研究するために、Methacarnは選択の固定剤です。それらをすべて修正するための1つの解決策はありますか? ないかなり…

しかし、タイトルが言うように”あなたが修正する前に考える”それは4%中性緩衝ホルムアルデヒドは、すべてのアプリケーションのための最 例えば、90年代初頭に私は精子形成を研究していたので、精巣に取り組んでいました。 精巣は、2つの主要な区画、尿細管および間質内に含まれる細胞の不均一な集団を有するかなり流動性の充填された器官である。

組織は固定を指示する

ラットには14段階の精子形成があり、精巣の任意の断面において精細管は14段階の一つとして特徴付けられる。 これらの段階は、異なる細胞型の形態学的外観の微妙な違いによって区別される。 精巣では、私はin-situハイブリダイゼーションを使用してmRNA発現を見てみたかった-ほとんどの文献は、in-situハイブリダイゼーションのために4%パラホルムアルデヒドを推奨していたので、私はどのような固定剤を選んだのですか? 答えはもちろんですが、私たちはよく、選んだ………いくつか! 少なくとも最初の評価のために-その理由は、パラホルムアルデヒドが精巣の細胞集団の微妙な違いを認識するために必要とされた形態学的保存の程度を与えないことを出版された文献から見ることができたからであった。

数十年前ですが、まだ結果が得られています

mRNAシグナルを得るかもしれませんが、精子形成の細胞型と段階を正確に識別できなければ、得ら そこで、我々はいくつかを選択し、最終的には、ISHによってわずかに敏感ではないシグナルを与えたが、精子形成のどの段階で遺伝子が発現されたかを特定するために必要な形態学的保存を与えたBouins流体を選択した。 これらの20歳のサンプルはまだ今日ISHに使用することができ、免疫組織化学のための非常に良い固定剤であることが私の手で証明されているので、

それを吸うと参照してください!Bouinsのすべてを修正することをお勧めしますか? もちろんそうではありません! それは私達のティッシュおよび私達の望ましい終点のための理想的な固定剤だったが、あらゆる適用にとって理想的であることを意味しない。 あなたの理想的な固定剤を見つけることはあなたのサンプルを固定する異なった方法を試み、異なった方法でそれらを準備し、異なった汚損の作戦を適用することを含むかもしれない。

Initial groundwork

ほとんどのアプリケーションでは、中間地点に固執することは確かに最初は固定のための良い戦略ですが、必要なエンドポイントを 方向を変更する柔軟性を持っているプロジェクトの開始近くにこれを行います。

最後に…

最後に、固定の選択をしたら(例: 固定剤、時間および温度)それからそれを一貫した保ち、知っているかだれが、まだ20年の時間にこれらのサンプルを使用できます!p>

これはあなたを助けましたか? その後、あなたのネットワークと共有してくださ

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