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La reazione a catena della polimerasi (PCR) è rimasta uno strumento di laboratorio estremamente importante per decenni. Sottili cambiamenti agli enzimi e cambiamenti drastici alla rilevazione di un risultato si sono verificati in quel lasso, ma lo strumento e la sua affidabilità sono rimasti notevolmente coerenti.

POST IMPORTATO *

Ci sono sempre commenti come quello qui sotto che riflette specificamente sul ritrovamento di materiale genetico MERS-CoV in persone asintomatiche o leggermente malate. Fondamentalmente si chiedono l’affidabilità della PCR.

Per quanto ne so, “infezione” è definita come la prova di un agente infettivo E la prova della moltiplicazione di questo agente all’interno del corpo (O della risposta infiammatoria associata che può essere collegata a questo agente). Quindi la mia domanda è: dove è stato prelevato il campione dalle infermiere “asintomatiche”? La PCR, come tutti sappiamo, rileva solo gli acidi nucleici. Quindi, se la moltiplicazione non può essere dimostrata e non viene fornita alcuna risposta infiammatoria locale o sistemica, come è stata esclusa la” contaminazione ” (non importa se dovuta a parti inattivate di MERS-CoV o addirittura a particelle virali complete)? Questa non è solo una domanda semantica, ma dovrebbe influire sul numero riportato di “casi”.

Prof Martin Haditsch scrivendo in ProMED

La sensazione che ho da questi è che alcuni non si fidano dei risultati della PCR o forse dei getter dei risultati. I risultati della PCR da soli non soddisfano la necessità di vedere la replica del virus in un host prima di assegnare qualsiasi tipo di ruolo causale a quel virus. Ma questo è spesso impraticabile e spesso inutile perché un risultato positivo PCR è generalmente un proxy affidabile per la presenza di infezione da virus attivo.

Coltivare un isolato non assegnerebbe causalità neanche a un pedante. Prova solo che il virus era nel campione del paziente. Allo stesso modo, un risultato sierologico positivo rileva anticorpi al virus, dimostrando solo che è stato riconosciuto dal sistema immunitario di un paziente infetto ad un certo punto. I tipi di studi necessari per dimostrare effettivamente la causalità sono di solito ben in basso nella lista delle priorità in una fase di gestione della salute pubblica come ci troviamo quando emerge un nuovo virus. Il miglior essere (completamente immorale) infezione umana seguita da infezione di altri primati e poi, scendendo l’elenco di pertinenza, ad altre creature pelose che possono essere uno stand-in adatto per la malattia negli esseri umani.

Piastra di reazione PCR.
Foto di David da Flickr

Non c’è una risposta facile per risolvere il problema di cui sopra. Molto ruota intorno a parole, pedanteria, linee guida, principi e criteri. Spesso questi sono supportati da molti diversi studi epidemiologici che si basano tutti pesantemente su buoni risultati di laboratorio. Risultati come quelli forniti dalla PCR. Come sappiamo, i postulati di Koch (oltre ad applicarsi ai batteri ed essere solo una guida) non reggono troppo bene nel mondo molecolare della virologia nuova ed emergente. Ci sono modifiche dei postulati però.

Altre collezioni come i criteri di Bradford Hill ottengono più di corsa in questi giorni. Certamente non si può testare un’influenza o CoV che uccide il 20-50% dei casi in cui si trova, usando volontari umani per riprodurre la malattia e dimostrare che l’agente era responsabile.

Ho riunito alcune riflessioni sul ruolo e l’affidabilità della PCR in una lista.

Cos’è la PCR (la versione rapida)

La PCR è un processo ciclico di cottura e raffreddamento guidato da enzimi che amplifica un tratto predefinito di DNA utilizzando una coppia di oligonucleotidi (brevi tratti di DNA) che chiamiamo primer (innescano il processo di copia del DNA che è alla base dell’amplificazione). Aggiungi un passo di trascrizione inversa in anticipo e puoi usare la PCR per amplificare il DNA fatto da un modello di RNA predefinito (il modello è la cosa che stiamo copiando e amplificando).

Nota a margine #1 – I virus sono dotati di genomi di DNA o RNA. Un risultato PCR positivo non dimostra la replica attiva di un virus. Non dimostra che il virus infettivo è presente. Questo è il motivo per cui preferiamo parlare di un virus rilevato in pazienti che utilizzano PCR. Alcuni si riferiscono ad un risultato positivo di PCR come “isolato virale” – non. Questo dovrebbe essere riservato per descrivere la crescita riuscita di eh di un virus facendo uso della coltura dell’organo/del tessuto/della cellula.

La PCR raddoppia il numero di pezzi di DNA bersaglio (copie o copie di DNA amplicon-significato di una singola specie) ogni ciclo (1 ciclo = ciclo di riscaldamento e raffreddamento). Più DNA/RNA si inizia con (di solito equivale alla carica virale) nel campione del paziente, prima si ottiene abbastanza copie da misurare utilizzando il metodo di rilevamento di scelta (oggi, per lo più segnale di fluorescenza). Ho una pagina sulla meccanica della PCR qui

Con la PCR, troviamo il virus più spesso

Negli ultimi tempi, con l’uso di metodi PCR molto sensibili nelle indagini sui virus respiratori che sono comuni, gli studi di ricerca hanno rilevato più spesso virus tra le persone campionate senza segni o sintomi di malattia also anche non sempre immediatamente prima o dopo se le persone sono seguite attentamente. Perché provare qualcuno se non sono malati? Bella domanda. Si consiglia di vedere se la trasmissione si verifica anche se una malattia non lo fa. Ma in passato, utilizzando metodi di coltura virus relativamente insensibili, avremmo avuto meno probabilità di rilevare un virus.

Nota a margine #2 – se stiamo cercando di dichiarare tale persona “asintomatica” – è meglio essere completamente sicuri che non abbiano assolutamente sintomi di un’infezione. La malattia, una deviazione dalla normale funzione del corpo, può essere lieve come un mal di testa o semplicemente sentirsi truffatore – e ancora, pedanticamente, essere una malattia attribuita al virus rilevato dalla PCR. Supponiamo che il livello di cura sia stato preso (spesso non lo è)

Nota a margine #3 – stiamo camminando su piattaforme per virus, batteri e funghi. Dai un’occhiata a questo articolo di Eric Delwart; in 2 bambini-il 92% dei campioni 72 raccolti settimanalmente per più di 250 giorni erano positivi al virus (nessun segno o lieve di malattia sviluppato durante questo periodo)! E ‘ molto probabile, come scopriamo agenti più diversi, meglio caratterizzarli e sviluppare (e utilizzare) funzionalità migliorate, che impareremo siamo quasi mai senza un passeggero o 3. Eppure non siamo sempre malati-perché è così?

L’immunità può tenerci bene, anche se infetti.

Il sistema immunitario in soccorso! Abbiamo un sistema immunitario molto capace, attivo e multifunzionale. Viene costantemente sfidato da things cose – non solo virus, batteri e funghi ma sostanze chimiche, varie proteine, carboidrati, allergeni, sporcizia e polvere (composta da pezzi di tutto ciò che altre cose) e fa un ottimo lavoro di smistamento attraverso tutto ciò, rispondendo a ciò di cui ha bisogno, per prevenire le malattie, e di solito schiacciando la risposta al resto in modo tale da non sottovalutare 24/7 a causa di allergie e malattie. È a causa di questo complesso sistema che non dovremmo sorprenderci che, poiché la tecnologia ci consente di trovare livelli più bassi di agenti infettivi, è del tutto ragionevole essere “infetti” ma non malati. Almeno in una parte dei nostri incontri con i virus, questo non dovrebbe essere una sorpresa.

Abbiamo molta esposizione al virus

Penso che valga la pena sottolineare che respiriamo fino a 60 litri di aria al minuto, con 0,1-7200 particelle submicroniche (aerosolizzate; 0,3-0,5 µm) per litro. In uno studio, l’RNA influenzale è stato trovato più spesso in particelle ≤5µM rispetto a quelle superiori a 5µM. Queste piccole particelle possono essere inalate ed espirate abbastanza facilmente e comunemente. Questo evidenzia solo quanto sia comune per noi inalare virus nelle nostre vie aeree

Sito di campionamento e trasmissione in casi asintomatici. Non ho dati per questo, ma mi sembra che se si tampona le vie aeree superiori, si è tamponato il sito da cui il virus è facilmente tossito, starnutito e quindi trasmesso in particelle più grandi. Se un virus viene rilevato lì, allora ci sembrerebbe essere una buona probabilità di trasmissione possibile. Succede? Questi studi non sono facilmente visibili… o forse non sono stati fatti.

Ma la contaminazione!

Il grande amplicone grigio amante delle arachidi nella stanza è contaminazione. Questo è amplicone da precedenti reazioni PCR che accidentalmente entra nei vostri nuovi reagenti PCR / pipette / laboratorio e ci dà un risultato positivo quando il paziente non è effettivamente infetto. È quello che alcuni pensano quando una PCR positiva si verifica in una persona asintomatica. È facile indicarlo come una ragione per un risultato spiacevole. Tuttavia, se il laboratorio è un esperto in PCR, allora i controlli necessari saranno in atto per dare avviso di contaminazione.

Inoltre, per alcuni virus e in alcuni laboratori, vengono impiegati più di un test PCR, ciascuno mirato a diverse regioni genetiche e utilizzando primer separati. Questo è il caso del flusso di lavoro raccomandato per lo screening MERS-CoV. Ciò non significa che questi sono i saggi utilizzati naturalmente. E cercare dettagli sul flusso di lavoro di test utilizzato è sempre utile per comprendere il contesto di un risultato PCR.

Altri passaggi utili includono laboratori separati per la preparazione del campione, la preparazione della miscela di reazione e il ciclismo; laboratori con flussi d’aria e di lavoro direzionali; tutto monouso; reagenti commerciali; kit pre – realizzati, specifici per l’obiettivo (“analiti”); molti controlli negativi e così via. Questi forniscono la fiducia considerevole in un risultato di PCR e sono pratica di lavoro standard per un laboratorio diagnostico professionale di PCR. È anche utile prelevare più di un campione da un caso sospetto.

I laboratori PCR necessitano di rack. I rack colorati assicurano il successo della PCR!
Foto dal laboratorio digitale MadLab Manchester su Flickr.

C’è un sacco di esperienza nel mondo PCR

PCR è stato utilizzato per rilevare i virus dal 1980 e ci sono molti esperti molto esperti nel suo uso che sanno come ottenere risultati affidabili ed evitare la contaminazione. Ci sono anche molte pubblicazioni che collegano il virus infettivo con un risultato PCR – la positività della PCR ha un significato e la letteratura lo supporta.

Quelli di noi che hanno condotto esperimenti di PCR su campioni umani per molti anni sapranno, la PCR non è così praticamente sensibile che rileverà regolarmente il virus che è appena seduto nel naso perché è stato inalato ma non si replica. I fattori di diluizione provvedono a questo.

Tuttavia, i problemi si verificano e esistono laboratori non professionali. Non c’è una risposta facile alle domande poste dal prof Martin Haditsch su ProMED. Come per qualsiasi test, l’affidabilità significa ridurre il rischio di guasti nel processo. Ma anche i laboratori esperti hanno brutte giornate.

  1. MERS-COV – MEDITERRANEO ORIENTALE (34): ARABIA SAUDITA, OMShttp://www.promedmail.org/post/1788112
    L’associazione tra mielite flaccida acuta (AFM) e Enterovirus D68 (EV-D68) – qual è la prova della causalità?
    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29386095
  2. Enterovirus D68 e flaccida acuta trasversa-valutare l’evidenza di causalità
    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29482893

*Importato Post

  1. Questo post da 27JUN2013 è stato pubblicato su sul mio vecchio blog piattaforma virologydownunder.di blogspot.com.au. Ora è stato spostato qui e leggermente modificata.

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