La conversione dell’mRNA in cDNA a doppio filamento

La conversione enzimatica dell’mRNA in DNA a doppio filamento può essere eseguita con una serie di procedure diverse. Tutti implicano l’azione della trascrittasi inversa e della sintesi innescata da oligonucleotide del cDNA. Successivamente, le procedure di uso comune divergono considerevolmente. Esistono numerosi metodi per sintetizzare il secondo filamento e diverse procedure per produrre estremità adatte per la produzione di DNA clonabile. Gli obiettivi principali di queste procedure sono quello di costruire inserire il DNA che è il più a lungo possibile, con un alto rendimento di conversione di mRNA in DNA che può legarsi al DNA vettoriale. I seguenti protocolli richiedono solo reagenti disponibili in commercio e di solito riescono a produrre buone librerie cDNA. Il protocollo di base descrive un metodo per creare cDNA con estremità smussata che può quindi essere legato ai linker per la successiva clonazione in un sito di restrizione univoco come EcoRI. Il protocollo alternativo è una variante che richiede meno manipolazioni enzimatiche e consente la costruzione di librerie cDNA direzionali, che sono particolarmente desiderabili quando l’obiettivo è generare librerie cDNA di espressione. Il protocollo alternativo sfrutta un linker-primer costituito da(in ordine da 3′ a 5′) un primer oligo (dT), un sito di restrizione per l’endonucleasi XhoI e una ripetizione (GA)20 per proteggere il sito di restrizione durante la generazione del cDNA con estremità smussata. I siti XhoI interni sulle singole molecole di cDNA sono protetti mediante incorporazione di 5-metil-dCTP nella miscela nucleotidica di primo filamento. I CDNA risultanti con estremità uniche possono essere clonati in vettori ECORI / XHOI digeriti dopo la legatura degli adattatori EcoRI all’estremità 5′ e la digestione da XhoI per rilasciare i siti 3′ XhoI che sono stati incorporati nel cDNA dal linker-primer. Queste modifiche si traducono in una procedura notevolmente semplificata che è sostanzialmente più veloce e più facile rispetto al protocollo di base.

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