delle cellule T e la risposta anticorpale indotta da una singola dose di ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222), il vaccino in un trial clinico di fase 1/2

Studio di procedure e di trattamento del campione

informazioni dettagliate sulla condotta di fase 1/2 trial randomizzato controllato di ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222), compreso il protocollo di sperimentazione, sono stati in precedenza published7. Questo studio è stato registrato a ISRCTN (15281137) e ClinicalTrials.gov (NCT04324606). Solo i dati provenienti da volontari vaccinati in dose singola sono inclusi in questo documento. Prima dell’iscrizione, tutti i partecipanti hanno dato il consenso informato scritto. Lo studio è stato condotto secondo i principi di buona pratica clinica e l’approvazione è stata ottenuta da un comitato etico nazionale (South Central Berkshire Research Ethics Committee, reference 20/SC/0145) e da un’agenzia di regolamentazione nel Regno Unito (the Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency). Un comitato indipendente per il monitoraggio della sicurezza dei dati è stato nominato prima dell’inizio del reclutamento.

I campioni di sangue sono stati raccolti il giorno della vaccinazione e 7, 14, 28 e 56 d dopo la vaccinazione. Ai tempi delle analisi immunologiche, sono stati prelevati campioni di sangue in provette di raccolta sia semplici che eparinizzate. I campioni sono stati elaborati entro 4 ore dal prelievo di sangue. I tubi semplici sono stati elaborati per la raccolta di siero di sangue. I tubi sono stati centrifugati a 1.800 rpm per 5 min e il siero è stato raccolto per la conservazione a -80 °C fino a quando richiesto. I tubi eparinizzati sono stati elaborati per la raccolta di PBMC e plasma sanguigno mediante centrifugazione a gradiente di densità. Il sangue è stato decantato in provette Leucosep (Greiner Bio-One) contenenti Lymphoprep (STEMCELL Technologies) e centrifugato a 1.000 g per 13 min con il freno spento. Una frazione di plasma sanguigno è stata raccolta e conservata a -80 °C, mentre il campione rimanente è stato decantato in una provetta Falcon fresca e rabboccato con supporti R0 (terreni di coltura cellulare RPMI-1640 contenenti 1% di penicillina–streptomicina e 2 mM di L-glutammina (tutti Sigma-Aldrich). I campioni sono stati centrifugati di nuovo a 1.800 giri al minuto per 5 minuti; il surnatante è stato versato fuori; e il pellet cellulare è stato risospeso ancora una volta in media R0 per il lavaggio. Dopo la centrifugazione, il pellet cellulare è stato risospeso in 10 ml di media R10 (RPMI–1640 contenente 1% penicillina-streptomicina, 2 mM L-glutammina e 10% siero di vitello fetale (FCS, Labtech) per il conteggio.

Le cellule sono state contate utilizzando un CasyCounter (OMNI Life Science) per l’uso in saggi freschi o per la crioconservazione. Le analisi eseguite su cellule fresche sono state ELISpot e ICS (descritte di seguito). Tutte le cellule rimanenti sono state congelate ad una concentrazione di 8-12 × 106 PBMCs per ml. Dopo la centrifugazione (1800 rpm, 5 min) le celle sono state risospese in FCS freddi a metà del volume totale di congelamento. Le celle sono state poste in frigorifero (2-8 °C) per 20 min prima di aggiungere un volume uguale di FCS freddo contenente il 20% di dimetilsolfossido. Le aliquote di un millilitro sono state preparate e rapidamente trasferite in celle frigorifere (Corning) per il congelamento a -80 °C durante la notte. I tubi sono stati quindi trasferiti in un congelatore a temperatura ultra-bassa di -150 ° C fino a quando richiesto.

Campioni di plasma convalescenti sono stati ottenuti da pazienti adulti ospedalizzati (≥18 anni) ricoverati con infezione da SARS-CoV-2 positivi alla reazione a catena della polimerasi o da operatori sanitari arruolati in studi di sorveglianza COVID-19. Gli studi sono stati approvati dai seguenti comitati: Malattie gastrointestinali a Oxford: COVID substudy (Sheffield Research Ethics Committee, reference 16 / YH/0247); ISARIC/WHO Clinical Characterisation Protocol for Severe Emerging Infections (Oxford Research Ethics Committee C, reference 13/SC/0149); e Sepsis Immunomics Project (Oxford Research Ethics Committee C, reference 19/SC / 0296). Entrambi i partecipanti asintomatici e sintomatici sono stati testati per ciascun test. In precedenza sono stati descritti ulteriori dettagli sulle procedure sperimentali eseguite su campioni di plasma convalescenti7.

Peptidi e stimolazioni

I peptidi che coprono l’intera lunghezza della sequenza proteica del picco SARS-CoV-2 sono stati sintetizzati per l’uso in saggi di cellule T antigene-specifici (ProImmune). Un totale di 253 peptidi sono stati sintetizzati come 15-mers sovrapposti da dieci aminoacidi. I peptidi sono stati anche sintetizzati per la sequenza leader tPA N-terminale, che è stata inclusa per aumentare l’espressione dell’antigene del vaccino dal vettore adenovirale. I dettagli delle sequenze peptidiche e del pooling per le analisi sono mostrati nella tabella supplementare 3. In breve, per il test Cytek Aurora flow cytometry, Meso Scale Discovery (MSD) Th1 / Th2 cytokine profiling assay e ICS, sono stati realizzati due pool di peptidi separati che coprono le subunità S1 (134 peptidi) e S2 (119 peptidi) della proteina spike SARS-CoV-2. Per il test ELISpot, sono stati realizzati 12 pool di 18-24 peptidi composti da sei pool ciascuno per le subunità S1 e S2. Un pool di sequenze leader TPA separato (cinque peptidi) è stato incluso in questo test.

Citometria a flusso condotta su un analizzatore spettrale Cytek Aurora

La citometria a flusso è stata eseguita da aliquote congelate di PBMC di donatori a partire dai giorni 0, 7, 14 e 28 dopo la vaccinazione con ChAdOx1 nCoV19 (D0 n = 24, D7 n = 23, D14 n = 25 e D28 n = 24). Le cellule sono state scongelate in supporti contenenti>5 U ml−1 di benzonasi e risospese in supporti RPMI completi integrati con 10% FCS, L-glutammina e penicillina–streptomicina ad una concentrazione di 2 × 107 cellule per ml. Quindi, 2 × 106 PBMCs per pozzetto sono stati placcati in una piastra a 96 pozzetti e stimolati con peptidi sintetici che coprono la proteina spike SARS-CoV−2 suddivisa in due pool separati per le subunità S1 e S2 (Tabella supplementare 3) ad una concentrazione finale di 2 µg ml-1 o media come controllo. Un pozzetto per donatore è stato stimolato con phorbol 12-miristato 13-acetato e ionomicina (Cocktail di attivazione cellulare, BioLegend) come controllo positivo. Le PBMC sono state co-stimolate in presenza di CD28 anti-umano, CD49d (1 µg ml−1; Life Technologies) e CD107a-BV785 (BioLegend) per 2 ore a 37 °C con il 5% di CO2 e quindi incubate per ulteriori 16 ore dopo l’aggiunta di 1 µg ml−1 di brefeldina A e monensina a ciascun pozzetto (BioLegend).

I PBMC sono stati lavati in FACS buffer (soluzione salina tamponata con fosfato con albumina sierica bovina allo 0,5% e 1% EDTA) e colorati con un cocktail di anticorpi superficiali, tra cui anti-human Live/Dead-Zombie UV, CD4-AF700, CD19-Spark NIR 685, CD56-APC, CCR7-PerCP / Cy5.5, PD1-PE/Dazzle 594, CD57-PE/Cy7(BioLegend) CD8-AF405, CD45RA-SuperBright 702, CD27-PerCP eF710 e CD20-AF532 (Thermo Fisher Scientific); CD16-BUV495, CD3-BUV661, CD138 BUV805, NKG2A-BV480 e IgM-BB515 (BD Biosciences); e NKG2C-PE e KLRG1-VioBlue (Miltenyi) in tampone FACS con il 10% di Brillante Macchia di Buffer Plus (BD Biosciences). I PBMC sono stati incubati a 4 °C al buio per 30 min e poi lavati due volte in FACS buffer. PBMCs sono stati poi incubati in CytoFix/CytoPerm soluzione (BD Biosciences) a 4 °C al buio per 30 minuti e poi lavate due volte in Perm/tampone di Lavaggio e quindi colorato con un cocktail di anticorpi intracellulari, tra cui anti-umano di IFN-γ-BV650 e IL-2-BV605 (BioLegend); IgG-BV421, TNF-α-BUV395, CD69-BV750, CD71 BUV563 e CD25-BV737 (BD Biosciences); e Ki-67-APC eF780 (Thermo Fisher Scientific) a Perm/Lavaggio. I PBMC sono stati incubati a 4 °C al buio per 30 min, lavati due volte in buffer Perm/Wash, una volta in buffer FACS e poi ri-sospesi in 200 µl di buffer FACS per l’acquisizione su un analizzatore spettrale Cytek Aurora a quattro laser personalizzato utilizzando SpectroFlo v2.2 (Cytek Biosciences).

La compensazione del singolo fluorocromo è stata calcolata su perline (BD Biosciences e Miltenyi) o PBMC umani. L’analisi dei dati è stata condotta in FlowJo (v10.6.2) mediante una strategia di gating gerarchica (Fig. 6) e Prism 8 (GraphPad). Le risposte specifiche del peptide sono state calcolate sottraendo i controlli non stimolati dai campioni stimolati dal peptide.

Downsampling e analisi tSNE sono state condotte su linfociti vivi gated in FlowJo v. 10.7.1. Un campione casuale di 100.000 cellule per donatore e punto di tempo è stato raccolto e concatenato in un unico file. Tutti i colori fluorocromo e il punto di tempo del campione sono stati inclusi come parametri. L’analisi tSNE è stata implementata in FlowJo v. 10.7.1 con 100.000 iterazioni e una perplessità di 30 e utilizzando l’algoritmo di gradiente Barnes–Hut.

MSD Th1/Th2 cytokine profiling

Th1 / Th2 risposte citochine sono state misurate in surnatanti di coltura tissutale dalla stimolazione di PBMCs con peptidi sintetici che coprono la proteina spike. Quindi, 5 × 105 PBMC appena isolati sono stati risospesi in 250 µl di supporti R10 in piastre a 96 pozzetti U-bottom e integrati con 1 µg ml−1 di anti-human CD28 e CD49d. I peptidi che coprono le subunità S1 e S2 della proteina spike SARS-CoV-2 (Tabella supplementare 3) sono stati aggiunti ai pozzetti separati ad una concentrazione di 2 µg ml−1. Ogni campione includeva anche un controllo non stimolato (solo su supporti). Dopo un’incubazione di 16-18 ore a 37 °C con il 5% di CO2, le cellule sono state pellettate mediante centrifugazione (1.800 rpm, 5 min) e sono stati raccolti 200 µl di surnatante. I supernatanti delle stimolazioni S1 e S2 sono stati combinati e conservati a -80 °C fino a quando richiesto.

Le risposte alle citochine sono state analizzate utilizzando il kit MSD V-PLEX Proinfiammatory Cytochine (human) Panel 1, convalidato da MSD. Ogni piastra è rivestita con nove diversi anticorpi monoclonali di cattura contro nove diverse citochine disposte in punti indipendenti sulla base di ciascun pozzetto. Citochine IFN-y, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13 e TNF-α sono state associate a una risposta delle cellule T di tipo Th1 o Th2.

I supernatanti sono stati diluiti 1:2 per i campioni non stimolati e 1:10 per i campioni stimolati S1 / S2 nel Diluente MSD 2. Il kit fornisce un calibratore liofilizzato multi-analita che, una volta ricostituito, verrà utilizzato come curva standard utilizzando una diluizione seriale di quattro volte per formare una curva standard di otto punti placcata in duplicato. Le misurazioni delle citochine sono state effettuate secondo le istruzioni del produttore. Le piastre sono state lette su un lettore MSD entro 15 minuti dall’aggiunta del buffer di lettura.

I dati sono stati analizzati utilizzando MSD Discovery Workbench 4.0. I campioni sono stati ripetuti se un campione ha avuto una replica con un coefficiente di variazione superiore al 20%. Le repliche sono state lette dalla curva standard e moltiplicate per il fattore di diluizione e la concentrazione è stata riportata come media delle repliche in pg ml−1. La concentrazione dal campione non stimolato è stata sottratta dalla concentrazione dallo stimolato (sottrazione di fondo). I valori negativi delle sottrazioni di sfondo sono stati sostituiti da zeri. Un valore arbitrario di 0.0001 è stato aggiunto alle sottrazioni in background su tutti i campioni per superare la presenza di valori nulli sollevati da campioni troppo bassi per essere letti dalla curva standard.

Isotipo e sottoclasse ELISA

Campioni di partecipanti vaccinati con ChAdOx1 nCoV-19 e campioni di plasma convalescenti sono stati analizzati per anti-spike I1, I3, IgA e IgM. I campioni dei partecipanti vaccinati con MenACWY sono stati analizzati solo per anticorpi anti-spike IgA e IgM. ELISA standardizzato è stato utilizzato per quantificare le risposte spike1, I3, IgA e IgM specifiche del picco di SARS-CoV-2 circolanti. In precedenza erano stati pubblicati dettagli metodologici completi per questo test23. Brevemente, le piastre ELISA sono state rivestite durante la notte con 5 µg ml−1 di SARS-CoV-2 full-length spike protein. Dopo il blocco con caseina bloccante in PBS (Thermo Fisher Scientific), i campioni (diluizione minima 1:50) sono stati incubati per 2 ore a 37 °C con agitazione a 300 giri / min. Curva standard e controlli interni sono stati creati dal siero di riferimento utilizzando un pool di siero donatore ad alto titolo. È stato quindi aggiunto un anticorpo secondario coniugato con fosfatasi alcalina (dipendente dalla sottoclasse o dall’isotipo delle immunoglobuline rilevate) e incubato per 1 ora a 37 °C con agitazione a 300 giri / min. Le piastre sono state sviluppate utilizzando il substrato di fosfatasi alcalina PNPP (Thermo Fisher Scientifc) per 1-4 ore a 37 °C con agitazione di 300 giri / min e lette a 405 nm quando il controllo interno ha raggiunto un OD405 di 1. I criteri Plate pass/fail sono descritti in ref. 23.

Isotipo e sottoclasse densità ottica ELISA

Le risposte antigene-specifiche I2, I4 e IgE sono state rilevate in assenza di un controllo sierico antigene-specifico mediante ELISA a densità ottica (OD). In precedenza sono state descritte procedure dettagliate per questo test23. In breve, le piastre ELISA sono state rivestite durante la notte con 5 µg ml−1 di proteina spike full-length SARS-CoV-2, più un controllo dell’immunoglobulina umana commerciale per l’isotipo anticorpale o sottoclasse da analizzare. Dopo il blocco con caseina bloccante in PBS, campioni di prova e controlli negativi pre-pandemici (minimo 1:50 diluizione) sono stati placcati fuori per 2 h a 37 ° C con 300 rpm agitazione. Sono stati aggiunti diversi anticorpi secondari coniugati con fosfatasi alcalina a seconda dell’isotipo o sottoclasse delle immunoglobuline da analizzare per 1 ora a 37 °C con agitazione di 300 giri / min. Le piastre sono state sviluppate utilizzando un substrato di fosfatasi alcalina PNPP per 1-4 ore a 37 ° C con agitazione a 300 giri / min e lette a 405 nm quando il controllo delle immunoglobuline ha raggiunto un OD405 specificato. I calcoli di taglio negativo sono descritti in ref. 23.

Avidità ELISA

È stata valutata l’avidità di IgG specifiche per il picco di SARS-CoV-2 da volontari che avevano una risposta quantificabile al giorno 28. L’avidità totale dell’anticorpo IgG anti-SARS-CoV-2 spike-specifico del siero del donatore è stata valutata mediante ELISA di spostamento del tiocianato di sodio (NaSCN). Le piastre ELISA di Nunc MaxiSorp (Thermo Fisher Scientific) sono state rivestite durante la notte (≥16 h) a 4 °C con 50 µl per pozzetto di 2 µg ml−1 di proteina trimerica spike SARS-CoV-2 diluita in PBS. Le piastre sono state lavate tre volte con PBS / Tween (0,05%) (PBS/T) e filettate a secco. Le piastre sono state bloccate per 1 ora con 100 µl per pozzetto di caseina bloccante in PBS (Thermo Fisher Scientific) a 20 °C. I campioni di prova e un pool di siero di controllo positivo sono stati diluiti in tampone bloccante per normalizzarli a un OD405 di 1 e 50 µl per pozzetto sono stati aggiunti in duplicato a ciascuna riga della piastra (tranne l’ultima riga, dove è stato aggiunto solo tampone bloccante). Le piastre sono state incubate per 2 h a 20 °C e poi lavate tre volte con PBS / T e filettate a secco. Concentrazioni crescenti di NaSCN (Sigma-Aldrich) diluito in PBS sono state aggiunte a 50 µl per pozzetto a ciascuna riga lungo la piastra (1 M, 2 M, 3 M, 4 M, 5 M e 6 M) ad eccezione della prima e dell’ultima riga, dove è stato aggiunto solo PBS. Le piastre sono state incubate per 15 min a 20 °C e poi lavate sei volte con PBS / T e filettate a secco. L’anticorpo anti-umano IgG (γ-chain specific) della fosfatasi alcalina prodotto in capra (Sigma-Aldrich) è stato diluito 1:1.000 nel tampone di blocco e 50 µl per pozzetto è stato aggiunto alla piastra. Le piastre sono state incubate per 1 h a 20 °C e poi lavate tre volte con PBS / T e filettate a secco. Quindi, sono stati aggiunti 100 µl per pozzetto di substrato di fosfatasi alcalina PNPP (Thermo Fisher Scientific) e le piastre sono state incubate a 20 °C. OD a 405 nm (OD405) è stato misurato utilizzando un lettore di assorbanza ELx808 (BioTek) fino a quando i pozzetti di campione non trattati hanno raggiunto un OD405 di 1 (0,8–2,0). Il software Gen5 ELISA v3.09 (BioTek) è stato utilizzato per tracciare il campione di prova OD405 contro la concentrazione di NaSCN e una funzione spline con fattore di levigatura 0.001 è stata montata sui dati. Per ogni campione, la concentrazione di NaSCN necessaria per ridurre l’OD405 al 50% di quella senza NaSCN (IC50) è stata interpolata da questa funzione e riportata come misura di avidità.

Test ex vivo IFN-γ ELISpot

I test ELISpot sono stati eseguiti su PBMC appena isolate prima e 14 d dopo la vaccinazione con ChAdOx1 nCoV19, come precedentemente descritto7. Le analisi sono state eseguite utilizzando Multiscreen IP ELISpot piastre (Millipore) e sono stati rivestiti durante la notte a 4 °C con 10 µg ml−1 di umano anti-IFN-γ rivestimento anticorpo (clone 1-D1K, Mabtech) in tampone carbonato, prima di lavare tre volte con PBS e blocco con la R10 media per 2-8 h. Quindi, 2.5 × 105 PBMCs sono stati aggiunti a ciascun pozzetto della piastra, con 13 piscine di peptidi che copre il SARS-CoV-2 proteina di spike e il N-terminale tPA sequenza leader alla concentrazione finale di 10 µg ml−1 (Tabella Supplementare 3). Ogni saggio è stato eseguito in triplice copia e incubato per 16-18 ore a 37 °C con il 5% di CO2.

Le piastre sono state quindi sviluppate lavando sei volte con PBS / T, seguito dall’aggiunta di 1 µg ml−1 di anticorpo rivelatore anti-IFN-γ (7-B6-1-Biotina) a ciascun pozzetto. Dopo un’incubazione di 2-4 ore, le piastre sono state lavate di nuovo e 1: 1.000 SA-ALP è stato aggiunto per 1-2 ore. Dopo una fase di lavaggio finale, le piastre sono state sviluppate utilizzando il substrato cromogenico BCIP NBT-plus (Moss).

Le piastre ELISpot sono state contate utilizzando un contatore ELISpot automatizzato AID (AID Diagnostika, algoritmo C), utilizzando impostazioni identiche per tutte le piastre e i conteggi spot sono stati regolati solo per rimuovere gli artefatti. Le risposte sono state calcolate in media tra i pozzetti triplicati e la risposta media dei pozzetti non stimolati (controllo negativo) è stata sottratta. I risultati sono espressi come SFCS / 106 PBMC. Le risposte a un peptide sono state considerate positive se le risposte sottratte in background erano > 40 SFU/106 PBMCs. Se le risposte erano >80 Sfc/106 PBMCs in pozzetti di controllo negativo (PBMCs senza l’antigene) o <800 Sfc/106 PBMCs in positivo pozzetti di controllo (pool enterotossina Stafilococcica B a 0.02 µg ml−1 e fitoemoagglutinina-L 10 µg ml−1), i risultati sono stati esclusi da ulteriori analisi.

ICS

ICS è stato eseguito su PBMC appena isolati stimolati con peptidi S1 e S2 raggruppati. Quindi, 3 × 106 PBMC sono stati risospesi in 5 ml di provette FACS in polipropilene ad un volume di 1 ml in supporti R10 integrati con 1 µg ml−1 di anti-human CD28 e CD49d e 1 µl di CD107a PE-Cy5 (eBioscience). I pool di peptidi S1 e S2 (tabella supplementare 3) sono stati aggiunti ad una concentrazione di 2 µg ml−1. Ogni campione includeva anche un controllo positivo (S. enterotossina B a 1 µg ml−1; Sigma Aldrich) e un controllo non stimolato (solo su supporti). Le cellule sono state incubate a 37 ° C con il 5% di CO2 per 16-20 ore, con brefeldina A (3 µg ml−1) e monensina (2 mM) (eBioscienza) aggiunte dopo 2 ore

Alla fine dell’incubazione, le cellule sono state lavate in tampone FACS (PBS contenente lo 0,1% di albumina sierica bovina e lo 0,01% NaN3) e trasferite in una piastra di coltura tissutale a fondo U da 96 pozzetti per la colorazione. Per la prima volta è stato aggiunto un cocktail di colorazione superficiale contenente 2,5 µl di una diluizione 1:40 di Aqua Live/Dead stain (Thermo Fisher Scientific) e 1 µl di BV711 CCR7 (BioLegend) in 46,5 µl di buffer FACS. Le cellule sono state incubate al buio per 20 min e lavate con tampone FACS. Quindi, 100 µl di soluzione CytoFix/CytoPerm (BD Biosciences) sono stati aggiunti a ciascun pozzetto e lasciati in incubazione per altri 20 minuti. Le cellule sono state poi lavate con tampone Perm / Wash prima di ICS. Il cocktail ICS conteneva 0,025 µl di CD45RA BV605, 0,025 µl di TNF-α PE-Cy7, 0,1 µl di IFN-γ FITC, 0,025 µl di CD14 e450, 0,025 µl di CD19 e450, 0,5 µl di CD3 AF700, 1 µl di IL-2 BV650, 1,25 µl di IL-5 2,5 µl di IL-13 APC, 3,5 µl di CD4 PerCP Cy5.5 e 5 µl di CD8 APC-eF780, per un volume totale di 50 µl diluiti nel buffer FACS. I campioni sono stati macchiati al buio per 30 min. Le cellule sono state lavate due volte con tampone Perm/Wash e due volte con tampone FACS prima di essere risospese in 100 µl di 1% di paraformaldeide.

I controlli di compensazione sono stati preparati freschi per ogni lotto utilizzando Onecomp eBeads (eBioscience). Le cellule sono state tenute su ghiaccio e tese attraverso un filtro da 35 µm prima dell’acquisizione. Le cellule sono state acquisite su un citometro a flusso BD LSRFortessa a cinque laser (BD Biosciences) utilizzando FACSDiva v8.02 (BD Biosciences) e i dati sono stati analizzati in FlowJo v10.7. Per l’analisi dei campioni è stata applicata una strategia gerarchica di gating (Fig. 7). È stato applicato un processo di controllo della qualità per rimuovere campioni con meno di 100.000 eventi nel gate live CD3+ e campioni con<risposta all ‘ 1% di citochine a S. enterotossina B (CD4+ e CD8+ IFN-γ+, CD8+ TNF-α+). È stato applicato un limite inferiore di rilevazione e sono stati inclusi nell’analisi solo campioni con una risposta ELISpot superiore a 200 SFCs/106 PBMC.

Analisi statistica

Tutti i test statistici, così come tutta la rappresentazione grafica dei dati, sono stati eseguiti in GraphPad Prism 8.4.3. I dati sono presentati come mediane con IQRs. Per verificare la normalità dei dati, sono stati utilizzati i test d’Agostino–Pearson. I campioni non accoppiati sono stati confrontati utilizzando i test Mann–Whitney U e i campioni accoppiati sono stati confrontati con il test Wilcoxon. Tutti i test erano a due code, con un tasso di errore del 5% per confronto. La correzione Bonferroni è stata utilizzata per correggere i confronti multipli. Le correlazioni sono state analizzate usando il rank test di Spearman. Valori di P inferiori a 0,05 sono stati considerati significativi.

Reporting Summary

Ulteriori informazioni sul design della ricerca sono disponibili nel Reporting Summary di Nature Research collegato a questo articolo.

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