elsődleges menü

a polimeráz láncreakció (PCR) évtizedek óta rendkívül fontos laboratóriumi eszköz maradt. Az enzimek finom változásai és az eredmény kimutatásának drasztikus változásai történtek ebben az időszakban, de az eszköz és megbízhatósága figyelemre méltóan következetes maradt.

importált hozzászólás *

mindig vannak olyan megjegyzések, amelyek alatt kifejezetten a MERS-CoV genetikai anyag tünetmentes vagy enyhén beteg embereknél történő megtalálásáról szól. Alapvetően csodálkoznak a PCR megbízhatóságán.

tudomásom szerint a” fertőzés ” a fertőző ágens bizonyítékaként és ennek a szernek a szervezetben történő szaporodásának bizonyítékaként (vagy ezzel a kórokozóval összekapcsolható gyulladásos válaszként) definiálható. Ezért a kérdésem az, hogy hol vették a mintát a “tünetmentes” ápolóktól? A PCR, mint mindannyian tudjuk, csak nukleinsavakat észlel. Tehát, ha a szaporodás nem bizonyítható, és nincs helyi vagy szisztémás gyulladásos válasz, hogyan zárták ki a” szennyeződést ” (függetlenül attól, hogy a MERS-CoV inaktivált részei vagy akár teljes vírusrészecskék okozzák)? Ez nem csak szemantikai kérdés, hanem hatással kell lennie a bejelentett “esetek”számára.

Prof Martin Haditsch írás ProMED

az az érzésem, hogy ezek az, hogy néhány nem bízik a PCR eredményeket, vagy talán az eredmény-getters. A PCR eredmények önmagukban nem elégítik ki annak szükségességét, hogy a gazdaszervezetben replikáló vírust lássanak, mielőtt bármilyen okozati szerepet tulajdonítanának ennek a vírusnak. De ez gyakran nem praktikus és gyakran szükségtelen, mert a pozitív PCR eredmény általában megbízható proxy az aktív vírusfertőzés jelenlétére.

egy izolátum tenyésztése nem rendelne okozati összefüggést egy pedáns számára sem. Ez csak azt bizonyítja, hogy a vírus a beteg mintájában volt. Hasonlóképpen, a pozitív szerológiai eredmény kimutatja a vírus elleni antitesteket, csak azt bizonyítva, hogy a fertőzött beteg immunrendszere valamikor felismerte. Az ok-okozati összefüggés tényleges bizonyításához szükséges tanulmányok általában jóval lejjebb vannak a prioritási listán egy közegészségügyi kezelési szakaszban, például amikor új vírus jelenik meg. A legjobb (teljesen etikátlan) emberi fertőzés, amelyet más főemlősök fertőzése követ, majd a relevancia listán lefelé haladva más szőrös fickók felé, amelyek alkalmasak lehetnek az emberek betegségére.

PCR reakciólemez.
fotó: David a Flickr-től

nincs egyszerű válasz a fenti probléma megoldására. Sok minden a szavak, a pedantria, az irányelvek, a tantételek és a kritériumok körül forog. Ezeket gyakran sok különböző epidemiológiai vizsgálat támasztja alá, amelyek mindegyike nagymértékben támaszkodik a jó laboratóriumi eredményekre. Eredmények, például a PCR által szolgáltatott eredmények. Mint tudjuk, Koch posztulátumai (eltekintve attól, hogy a baktériumokra vonatkoznak, és csak útmutatóként szolgálnak) nem állnak túl jól az új és feltörekvő virológia molekuláris világában. Vannak azonban módosítások a posztulátumokban.

más gyűjtemények, mint például a Bradford Hill kritériumok, manapság többet futnak. Természetesen nem lehet tesztelni az influenzát vagy a CoV-t, amely az esetek 20-50% – át megöli, emberi önkénteseket használva a betegség reprodukálására és annak bizonyítására, hogy a kórokozó felelős.

összegyűjtöttem néhány elmélkedést a PCR szerepéről és megbízhatóságáról egy listában.

mi a PCR (a gyors verzió)

a PCR egy enzimvezérelt ciklikus szakács-és hűtési folyamat, amely egy előre meghatározott DNS-szakaszt felerősíti egy pár, egyformán előre meghatározott és kereskedelmi forgalomban előállított oligonukleotid (rövid DNS-szakaszok) segítségével, amelyeket primereknek nevezünk (ezek alapozzák meg az amplifikációt alátámasztó DNS-másolási folyamatot). Adjon hozzá egy fordított transzkripciós lépést előre, és PCR – t használhat egy előre meghatározott RNS-sablonból készült DNS amplifikálására (a sablon az a dolog, amit másolunk és erősítünk).

1.Mellékjegyzet – a vírusok DNS vagy RNS genomokkal érkeznek. A pozitív PCR eredmény nem bizonyítja a vírus aktív replikációját. Nem bizonyítja, hogy fertőző vírus van jelen. Ezért inkább arról beszélünk, hogy a PCR-t használó betegeknél vírust észlelnek. Egyesek a PCR pozitív eredményt “vírusizolátumnak” nevezik – nem. ezt fenn kell tartani a vírus eh sikeres növekedésének leírására sejt/szövet/szervkultúra felhasználásával.

a PCR minden ciklusban megduplázza a cél DNS darabszámát (másolatok vagy amplikon-azaz egyetlen faj DNS-másolatai) (1 ciklus = fűtési és hűtési kör). Minél több DNS / RNS-t kezd (általában megegyezik a vírusterheléssel) a beteg mintájában, annál hamarabb kap elegendő másolatot a választott kimutatási módszerrel (ma többnyire fluoreszcencia jel). Van egy oldalam a PCR mechanikájáról itt

A PCR-rel gyakrabban találunk vírust

későn, nagyon érzékeny PCR-módszerek alkalmazásával a légúti vírusvizsgálatokban mindennaposak, kutatási tanulmányok gyakrabban észleltek vírust a mintában szereplő emberek között, akiknek nincs jele vagy tünete a betegségnek…szintén nem mindig közvetlenül előtt vagy után, ha az embereket gondosan követik. Miért mintát valaki, ha nem beteg? Jó kérdés. Érdemes megnézni, hogy az átvitel akkor is megtörténik-e, ha egy betegség nem. De a múltban, viszonylag érzéketlen víruskultúra módszerekkel, kevésbé valószínű, hogy vírust észleltünk volna.

Mellékjegyzet #2 – ha egy ilyen személyt “tünetmentesnek” akarunk nyilvánítani – jobb, ha teljesen biztosak vagyunk abban, hogy nincsenek fertőzés tünetei. A betegség, a normál testfunkciótól való eltérés lehet olyan enyhe, mint a fejfájás vagy csak a szélhámosság érzése – és mégis pedantikusan a PCR által kimutatott vírusnak tulajdonítható betegség. Tegyük fel, hogy az ellátás szintje megtörtént (gyakran nem)

Oldaljegyzet #3 – sétálunk platformok vírusok, baktériumok és gombák. Vessen egy pillantást erre a papírra Eric Delwart;-ban 2 gyerekek-92%-a 72 hetente gyűjtött minták több mint 250 nap volt vírus-pozitív (nem vagy enyhe jelei betegség alakult ki ez idő alatt)! Nagyon valószínű, hogy mivel több különböző ügynököt fedezünk fel, jobban jellemezzük őket, és fejlesztjük (és használjuk) a továbbfejlesztett képességeket, megtanuljuk, hogy alig vagyunk utas vagy 3 nélkül. De nem mindig vagyunk betegek – miért van ez?

az immunitás jól tarthat minket, még akkor is, ha fertőzött.

az immunrendszer a mentő! Nagyon alkalmas, aktív és multifunkcionális immunrendszerünk van. Folyamatosan támadják a … dolgok – nem csak vírusok, baktériumok és gombák, hanem vegyi anyagok, különböző fehérjék, szénhidrátok, allergének, kosz és por (az összes többi dolog bitjeiből áll), és nagyszerű munkát végez, hogy válogatja az egészet, reagáljon arra, amire szüksége van, hogy megakadályozza a betegségeket, és általában összenyomja a választ a többire oly módon, hogy ne teljesítsünk alul 24/7-et allergia és betegség miatt. Ennek az összetett rendszernek köszönhető, hogy nem szabad meglepődnünk, hogy mivel a technológia lehetővé teszi számunkra, hogy alacsonyabb szintű fertőző ágenseket találjunk, teljesen ésszerű, hogy “fertőzöttek” legyünk, de nem betegek. Legalábbis a vírusokkal való találkozásunk bizonyos arányában ez nem lehet meglepő.

nagyon sok vírusnak vagyunk kitéve

azt hiszem, érdemes kiemelni, hogy percenként akár 60 liter levegőt lélegezünk be, 0,1-7200 szubmikron részecskével (aeroszolizált; 0,3-0,5 köbméter) literenként. Az egyik vizsgálatban az influenza RNS-t gyakrabban találták meg a részecskékben, mint az 5 GB-nál nagyobb részecskékben. Ezek a kis részecskék könnyen és gyakran belélegezhetők és kilégezhetők. Ez csak rávilágít arra, hogy valószínűleg mennyire gyakori számunkra a vírusok belélegzése a légutakba

Mintahely és az átvitel tünetmentes esetekben. Erre nincs adatom, de számomra úgy tűnik, hogy ha a felső légutakat tamponozza, akkor megtisztította azt a helyet, ahonnan a vírus könnyen köhöghet, tüsszenthet, ezért nagyobb részecskékben terjed. Ha vírust észlelnek ott, akkor úgy tűnik, hogy jó esély van az átvitelre. Előfordul? Ezek a tanulmányok nem könnyen láthatók… vagy talán nem készültek el.

de a szennyeződés!

a nagy szürke földimogyoró-szerető amplikon a szobában szennyeződés. Ez a korábbi PCR-reakciókból származó amplikon, amely véletlenül bekerül az új PCR-reagensekbe/pipettákba / laboratóriumba, és pozitív eredményt ad, ha a beteg valójában nem fertőzött. Ez az, amit egyesek gondolnak, amikor egy PCR pozitív tünetmentes személyben fordul elő. Könnyű rámutatni erre a kellemetlen eredmény okaként. Ha azonban a laboratórium a PCR szakértője, akkor a szükséges ellenőrzések a helyén lesznek, hogy figyelmeztessék a szennyeződést.

továbbá egyes vírusok és egyes laboratóriumok esetében egynél több PCR-vizsgálatot alkalmaznak, amelyek mindegyike különböző genetikai régiókat céloz meg, és külön primereket használ. Ez a helyzet a MERS-CoV szűréshez ajánlott munkafolyamattal. Ez nem azt jelenti, hogy ezeket a vizsgálatokat természetesen használják. A használt tesztelési munkafolyamat részleteinek keresése mindig hasznos a PCR-eredmény kontextusának megértéséhez.

további hasznos lépések: külön laboratóriumok a minta előkészítéséhez, a reakciókeverék előkészítéséhez és a kerékpározáshoz; irányított levegő – és munkafolyamatokkal rendelkező laboratóriumok; eldobható minden; kereskedelmi reagensek; előre elkészített, célspecifikus készletek (“analitok”); sok negatív kontroll és így tovább. Ezek jelentős bizalmat nyújtanak a PCR eredményében, és a professzionális diagnosztikai PCR laboratórium szokásos munkamódszerei. A gyanús esetből egynél több minta vétele szintén hasznos.

a PCR laboratóriumoknak állványokra van szükségük. A színes állványok biztosítják a PCR sikerét!
fotó: MadLab Manchester digitális laboratórium a Flickr-en.

sok szakértelem van a PCR világában

a PCR-t az 1980-as évek óta használják a vírusok kimutatására, és sok nagyon hozzáértő szakértő van a használatában, akik tudják, hogyan lehet megbízható eredményeket elérni és elkerülni a szennyeződést. Számos olyan publikáció is létezik, amely összekapcsolja a fertőző vírust a PCR eredményével – a PCR pozitivitásnak van értelme, és a szakirodalom ezt alátámasztja.

azok közülünk, akik sok éven át PCR-kísérleteket végeztek emberi mintákon, tudni fogják, hogy a PCR gyakorlatilag nem olyan érzékeny, hogy rendszeresen kimutatja a vírust, amely csak az orrában ül, mert belélegezték, de nem replikálódik. A hígítási tényezők gondoskodnak erről.

mégis, problémák történnek, és nem szakmai laborok léteznek. Nincs könnyű válasz a Prof Martin Haditsch által a ProMED-en feltett kérdésekre. Mint minden tesztnél, a megbízhatóság a folyamat hibáinak kockázatának csökkentését jelenti. De még a szakértői laboratóriumoknak is vannak rossz napjaik.

  1. MERS-COV – kelet-mediterrán (34): Szaúd – Arábia, WHOhttp://www.promedmail.org/post/1788112
    az akut petyhüdt myelitis (AFM) és az enterovírus D68 (EV-D68) közötti összefüggés-mi a bizonyíték az okozati összefüggésre?
    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29386095
  2. Enterovirus D68 és akut petyhüdt myelitis-értékelése a bizonyítékok ok-okozati
    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29482893

* importált hozzászólás

  1. ez a bejegyzés a 27jun2013 volt kifüggesztett át a régi blog platform virologydownunder.blogspot.com.au. most áthelyezték ide, és könnyedén szerkesztették.

találatok: 9785

mint a betöltés…

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.