a cisztein gyors oxidációja Cisztinné vizes oldatokban – a kiégett Média elemzésének következményei

töltse le ezt a megjegyzést (PDF)

cisztein oxidáció sejttenyészetekben

a sejttenyészetek általában biztosítják a sejtek növekedéséhez szükséges összes aminosavat. Egy vagy több aminosav korlátozása nemcsak a sejttenyészetek optimális növekedését eredményezi, hanem negatívan befolyásolja a termék hozamát és minőségét. A folyamatfejlesztés során az elhasznált média elemzése segít az aminosav-koncentrációk monitorozásában és a fogyasztási arányok meghatározásában az ilyen korlátozások észlelése és elkerülése érdekében.

Ez különösen nagy kihívást jelent a cisztein esetében, mivel könnyen oxidálódik, hogy cisztint képezzen, amely két cisztein molekula dimere, diszulfid-hídon keresztül csatlakozik. A közelmúltban a sejttenyészetek hőmérsékletének és tárolási stabilitásának szentelt tanulmány arról is beszámolt, hogy a cisztein aminosav különösen instabil a vizsgált körülmények között (Krattenmacher et al., 2018). Ez összhangban van tapasztalatainkkal, mivel gyakran nem vagy csak cisztein nyomokat mérünk, míg a cisztint – oxidált formáját – egyértelműen kimutatjuk. Kísérleteket végeztünk a cisztein és a cisztin vízben való redox viselkedésének vizsgálatával, szem előtt tartva, hogy a (kiégett) sejttenyészetekben található összetettebb körülmények megkönnyíthetik a bonyolultabb kémiát.

a cisztein cisztinná való átalakulása vízben

annak érdekében, hogy többet tudjunk meg a cisztein (in-)stabilitásáról, 1 mM-es oldatot készítettünk vízben, szobahőmérsékleten tároltuk, és különböző időpontokban vettünk mintákat. Vettünk több mintát során 26 h, majd egy” hosszú távú ” minta után 6 napok. Minden mintát közvetlenül a mintavétel után deriváltunk, és a szabadalmaztatott aminosav-analízis gradiensünkkel mértük egy Agilent 1290 UHPLC-DAD rendszeren. A 0,5 mM-es cisztin oldatot ugyanúgy kezeltük, és kontrollként szolgált.

amint az az 1. táblázatban és az 1. ábrán látható, még egy frissen elkészített cisztein oldat (0 óra) mintája is kimutatható mennyiségű cisztint tartalmazott. Az aminosav már 11% – a kezdetben dimer formájában volt jelen. Ez az érték az első órákban meglehetősen stabil volt, valószínűleg azért, mert a cisztein már tartalmazott cisztint az oldódás előtt. 24 óra elteltével több cisztein tolódott el a cisztin felé, ami 65% ciszteint és 35% cisztint eredményezett. 6 nap elteltével a cisztein 98% – a cisztinné alakult át (2.ábra).

a ciszteinnel ellentétben a cisztin oldatban stabilnak bizonyult. Koncentrációja állandó maradt, és egyik kontrollmintában sem volt kimutatható cisztein (lásd 2.táblázat, 1+2. ábra).

a fent leírt méréseken kívül a cisztein és cisztin oldatok alikvotjait DTT-vel (ditiotreitol) vagy TCEP-vel (trisz(2-karboxi-etil)foszfinnal), két közös redukálószerrel kezeltük. Amint azt a 3-6. táblázat mutatja, mindkét reagens megvédte a ciszteint a cisztin oxidációjától,sőt szinte teljesen csökkentette a cisztint a cisztein szabaddá. A TCEP csökkentő hatása erősebb volt a DTT-hez képest.

következtetés

a cisztein a sejttenyészeti táptalajok gyakori alkotóeleme, de a vizes oldatokban való instabilitása miatt gyakran nem észlelhető az elhasznált táptalaj mintáiban. Az ebben a megjegyzésben leírt kísérlet azt mutatja, hogy a cisztein elsősorban oxidálódik cisztin képződésére. A cisztein cisztinné történő oxidációja azt is jelenti, hogy a ciszteint és a cisztint nem szabad ugyanabban a standard keverékben szerepeltetni. Ehelyett a cisztein egyedi szabványai előállíthatók és védhetők az oxidációtól a TCEP segítségével.

továbbá megfigyeltük a cisztein oxidációját, hogy még gyorsabban haladjon tovább a további ciszteinnel tüskés sejttenyészetekben (az adatok nem jelennek meg). Ezt figyelembe kell venni, amikor a potenciális aminosav-korlátokat kiégett médiaelemzéssel elemzik. Ezért fontos a megfelelő mennyiségi módszerek alkalmazása.

beleértve a ciszteint és a cisztint, az aminosav-elemzési módszerünk kvantitatív eredményeket ad az összes proteinogén aminosavra, valamint az etanol-aminra, a citrullinra, a hidroxiprolinra, az ornitinre és a taurinra. Vegye fel velünk a kapcsolatot, hogy további információkat kérjen és tesztelje.

gyors és megbízható aminosav analízis

táblázatok és ábrák

lap. 1

lap. 1: relatív összegek (rel. Amt.) cisztein és cisztin frissen elkészített 1 mM-es cisztein vízben, uhplc-DAD-val mérve derivatizáció után. A mintavételi idő órákban / napokban jelenik meg az elkészítés után.

lap. 2

lap. 2: relatív összegek (rel. Amt.) cisztein és cisztin frissen elkészített 0,5 mM-es cisztin vízben, uhplc-DAD-val mérve derivatizáció után. A mintavételi idő órákban / napokban jelenik meg az elkészítés után.

lap. 3

lap. 3: relatív összegek (rel. Amt.) cisztein és cisztin frissen elkészített 1 mM cisztein plusz 0,5 mM DTT vízben, uhplc-DAD-val mérve derivatizáció után. A mintavételi idő órákban / napokban jelenik meg az elkészítés után.

lap. 4

lap.4: relatív összegek (rel. Amt.) cisztein és cisztin frissen elkészített 1 mM cisztein plusz 0,5 mM tcep vízben, uhplc-DAD-val mérve derivatizáció után. A mintavételi idő órákban / napokban jelenik meg az elkészítés után.

lap. 5

lap.5: relatív összegek (rel. Amt.) cisztein és cisztin frissen elkészített 0,5 mM-es cisztin plusz 0,5 mM-es DTT vízben, uhplc-DAD-val mérve derivatizáció után. A mintavételi idő órákban / napokban jelenik meg az elkészítés után.

lap. 6

lap.6: relatív összegek (rel. Amt.) cisztein és cisztin frissen elkészített 0,5 mM cisztin plusz 0,5 mM tcep vízben, uhplc-DAD-val mérve derivatizáció után. A mintavételi idő órákban / napokban jelenik meg az elkészítés után.

ábra. 1

ábra. 1: Cisztein / cisztin mérések 0h az oldatok elkészítése után. Az első ablaktábla a redukálószer nélküli méréseket, a második DTT-csökkentést és a harmadik tcep-csökkentést mutatja. A megjelenített uhplc-DAD kromatogramok a származtatás után mért cisztein és cisztin csúcsokra összpontosítanak.

ábra. 2

ábra. 2: cisztein / cisztin mérések 6d az oldatok elkészítése után. Az első ablaktábla a redukálószer nélküli méréseket, a második DTT-csökkentést és a harmadik tcep-csökkentést mutatja. A megjelenített uhplc-DAD kromatogramok a származtatás után mért cisztein és cisztin csúcsokra összpontosítanak.

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.