A Chadox1 ncov-19 (AZD1222) vakcina egyetlen dózisa által indukált T-sejt-és antitestválaszok egy 1/2 fázisú klinikai vizsgálatban

vizsgálati eljárások és mintafeldolgozás

a chadox1 nCoV 1/2 fázisú randomizált, kontrollos vizsgálatának lefolytatásával kapcsolatos összes részlet 19 (azd1222), beleértve a kísérleti protokollt is, korábban közzétették7. Ezt a vizsgálatot az ISRCTN-nél (15281137) regisztrálták, és ClinicalTrials.gov (NCT04324606). Csak az egyadagos oltott önkéntesek adatai szerepelnek ebben a cikkben. A beiratkozás előtt minden résztvevő írásbeli tájékozott beleegyezést adott. A vizsgálatot a helyes klinikai gyakorlat elvei szerint végezték, és jóváhagyást kaptak egy nemzeti etikai Bizottságtól (South Central Berkshire Research Ethics Committee, reference 20/SC/0145) és egy egyesült királyságbeli szabályozó ügynökségtől (the Medicines and Healthcare Products Regulatory Agency). A toborzás megkezdése előtt független adatbiztonsági ellenőrző testületet neveztek ki.

a vérmintákat a vakcinázás napján, a vakcinázást követően pedig 7, 14, 28 és 56 d napon vették. Az immunológiai elemzések időpontjaiban vérmintákat vettek mind sima, mind heparinizált gyűjtőcsövekben. A mintákat a vérvételtől számított 4 órán belül dolgoztuk fel. Sima csöveket dolgoztunk fel a vérszérum gyűjtésére. A csöveket 1800 fordulat / perc sebességgel centrifugáltuk 5 percig, és a szérumot -80 cc-os tárolásra betakarítottuk, amíg szükséges. A heparinizált csöveket pbmc-k és vérplazma gyűjtésére dolgozták fel sűrűséggradiens centrifugálással. A vért Lymphoprep-et (STEMCELL Technologies) tartalmazó Leucosep csövekbe (Greiner Bio-One) dekantáltuk, majd 1000 g-on centrifugáltuk 13 percig, kikapcsolt fékkel. A vérplazma egy részét összegyűjtöttük és tároltuk -80 cc-nál, míg a fennmaradó mintát egy friss Falcon csőbe dekantáltuk, és R0 táptalajjal (RPMI – 1640 sejtkultúra táptalaj, amely 1% penicillin–sztreptomicint és 2 mM L-glutamint (minden Sigma-Aldrich) tartalmaz. A mintákat ismét centrifugáltuk 1800 fordulat / perc sebességgel 5 percig; a felülúszót leöntöttük; a sejtpelletet ismét R0 közegben reszuszpendáltuk mosáshoz. Centrifugálás után a sejtpelletet 10 ml R10 közegben reszuszpendáltuk (RPMI–1640, amely 1% penicillin-sztreptomicint, 2 mM L-glutamint és 10% magzati borjúszérumot (FCS, Labtech) tartalmazott a számláláshoz.

a sejteket CasyCounter (OMNI Life Science) segítségével számoltuk friss vizsgálatokhoz vagy krioprezervációhoz. A friss sejteken végzett vizsgálatok csak az ELISpot és az ICS voltak (az alábbiakban ismertetjük). Az összes megmaradt sejtet 8-12 106 pbmcs / ml koncentrációban fagyasztottuk. Centrifugálás után (1800 fordulat / perc, 5 perc) a sejteket hideg FCS-ben reszuszpendáltuk a teljes fagyasztási térfogat felénél. A sejteket hűtőszekrénybe (2-8 C) helyeztük 20 percig, mielőtt azonos térfogatú, 20% dimetil-szulfoxidot tartalmazó hideg FCS-t adtunk hozzá. Egy milliliter alikvotokat készítettünk, és gyorsan átvisszük a Coolcellákba (Corning), hogy -80 cc-os éjszakán át fagyaszthassuk. A csöveket ezután -150-ig átvitték a -150ccc ultra-alacsony hőmérsékletű fagyasztóba, amíg szükséges.

lábadozó plazmamintákat kaptak kórházi felnőtt (18 éves) betegektől, akiket polimeráz láncreakció-pozitív SARS-CoV-2 fertőzéssel vagy a COVID-19 felügyeleti vizsgálatokba beiratkozott egészségügyi dolgozóktól vettek be. A vizsgálatokat a következő bizottságok hagyták jóvá: gastrointestinalis betegség Oxfordban: COVID substudy (Sheffield Research Ethics Committee, reference 16/YH/0247); Isaric/WHO klinikai Jellemzési protokoll súlyos kialakuló fertőzésekre (Oxford Research Ethics Committee C, reference 13/SC/0149); és Sepsis Immunomics Project (Oxford Research Ethics Committee C, reference 19/SC/0296). Mind a tünetmentes, mind a tüneti résztvevőket minden vizsgálat során tesztelték. A lábadozó plazmamintákon végzett kísérleti eljárások további részleteit korábban ismertük7.

peptideket és stimulációkat

a SARS-CoV-2 tüskefehérje-szekvencia teljes hosszán átívelő peptideket szintetizáltunk antigén-specifikus T-sejt-vizsgálatokhoz (ProImmune). Összesen 253 peptidet szintetizáltunk 15-mers-ként, tíz aminosavval átfedve. Peptideket is szintetizáltunk az N-terminális tPA leader szekvenciához, amelyet a vakcina antigén expressziójának növelése érdekében tartalmaztunk az adenovírus vektorból. A peptidszekvenciák és a vizsgálatok összevonásának részleteit a 3. Kiegészítő táblázat tartalmazza. Röviden, A Cytek Aurora flow citometriai vizsgálathoz, a Meso Scale Discovery (MSD) Th1/Th2 citokin profilozási vizsgálathoz és az ICS-hez két különálló peptidkészletet készítettek a SARS-CoV-2 tüskefehérje S1 (134 peptid) és S2 (119 peptid) alegységeire. Az ELISpot vizsgálathoz 12, 18-24 peptidből álló medencét készítettek, amelyek egyenként hat medencéből álltak az S1 és S2 alegységek számára. Ebben a vizsgálatban külön tPA leader szekvencia-készletet (öt peptidet) vontak be.

A Cytek Aurora spektrális analizátoron végzett áramlási citometriát

az áramlási citometriát donorok pbmc-jeinek fagyasztott alikvotjaiból végeztük a ChAdOx1 nCoV19 vakcinázást követő 0., 7., 14. és 28. naptól kezdve (D0 n = 24, D7 n = 23, D14 n = 25 és D28 n = 24). A sejteket >5 U ml−1 Benzonázt tartalmazó táptalajban kiolvasztottuk, és 10% FCS-vel, l–glutaminnal és penicillin-sztreptomicinnel kiegészített teljes rpmi táptalajban reszuszpendáltuk 2 107 sejt / ml koncentrációban. Ezután 2 db 106 db pbmc-t vontunk be egy 96-lyukú lemezbe, és szintetikus peptidekkel stimuláltuk, amelyek a SARS-CoV-2 tüskefehérjét két különálló medencére osztották az S1 és S2 alegységek számára (3.Kiegészítő táblázat), 2 db ml−1 végső koncentrációban, vagy kontrollként közegként. Donoronként egy kút stimulált phorbol 12-mirisztát 13-acetáttal és ionomicinnel (Sejtaktivációs koktél, BioLegend) pozitív kontrollként. A pbmc-ket egyidejűleg stimulálták anti-humán CD28, CD49d jelenlétében (1 USD ml−1; Life Technologies) és a CD107a-BV785 (BioLegend) 2 órán át 37 Celsius−fokon, 5% CO2-vel, majd további 16 órán át inkubáljuk, miután minden egyes kúthoz hozzáadtunk 1 GB ml-1 brefeldin A-t és monenzint (BioLegend).

a Pbmc-ket FAC pufferben mostuk (foszfátpufferelt sóoldat 0,5% szarvasmarha szérum albuminnal és 1% EDTA-val), és felszíni antitestek koktéljával festettük, beleértve az anti-humán élő/halott zombi UV-t, CD4-AF700, CD19-Spark NIR 685, CD56-APC, CCR7-PerCP/Cy5.5, PD1-PE/Dazzle 594, CD57-PE/Cy7(BioLegend) CD8-AF405, CD45RA-SuperBright 702, CD27-PerCP eF710 és CD20-AF532 (Thermo Fisher Scientific); CD16-BUV495, CD3-BUV661, CD138-BUV805, NKG2A-BV480 és IgM-BB515 (BD Biosciences); és nkg2c-pe és KLRG1-Vioblue (Miltenyi) a FACS pufferben 10% brilliant STAIN buffer Plus (BD Biosciences). A pbmc-ket inkubáltuk 4 CC-n sötétben 30 percig, majd kétszer mostuk FACS pufferben. A pbmc-ket ezután CytoFix/CytoPerm oldatban (BD Biosciences) inkubáltuk 4 CBC-n sötétben 30 percig, majd kétszer Perm/Wash pufferben mostuk, majd intracelluláris antitestek koktéljával festettük, beleértve az anti-humán IFN-bv650-et és az IL-2-BV605-et (BioLegend); IgG-BV421, TNF- ++ -BUV395, CD69-BV750, CD71-BUV563 és CD25-bv737 (BD Biosciences); és Ki-67-APC ef780 (Thermo Fisher Scientific) Perm/wash-ban. A pbmc-ket 4-nél inkubáltuk C-on sötétben 30 percig, kétszer mostuk Perm/mosás pufferben, egyszer FACS pufferben, majd 200-ban újra szuszpendáltuk a FAC puffer megszerzése céljából egy egyedi négylézeres Cytek Aurora spektrális analizátor segítségével SpectroFlo v2.2 (Cytek Biosciences).

az egyszeres fluorokróm kompenzációt gyöngyökre (BD Biosciences and Miltenyi) vagy humán Pbmc-kre számítottuk. Az adatok elemzését a FlowJo-ban (v10.6.2) hierarchikus kapuzási stratégiával végeztük (kiegészítő ábra. 6) és Prism 8 (GraphPad). A peptid-specifikus válaszokat úgy számítottuk ki, hogy a peptid-stimulált mintákból kivontuk a nem stimulált kontrollokat.

a flowjo V.10.7.1-ben zárt élő limfocitákon Lemintázást és tSNE analízist végeztek. Donoronként és időpontonként 100 000 sejtből álló véletlenszerű mintát gyűjtöttünk össze, és egyetlen fájlba összefűztük. Az összes fluorokróm színt és a minta időpontját paraméterként vettük figyelembe. A tSNE elemzést a FlowJo V.10.7.1–ben hajtották végre 100 000 iterációval és 30-as zavarral, Barnes-Hut gradiens algoritmust használva.

MSD Th1/Th2 citokin profilalkotás

th1 / Th2 citokin válaszokat mértünk szövetkultúrában felülúszók a Pbmc-knek a spike fehérjét lefedő szintetikus peptidekkel történő stimulálásából. Ezután 5 db 105 frissen izolált Pbmc-t reszuszpendáltunk 250 db R10 táptalajon 96 kútú u-fenéklemezeken, és 1 db ml−1 anti-humán CD28 és CD49d-vel egészítettük ki. a SARS-CoV−2 tüskefehérje S1 és S2 alegységeit felölelő peptideket (3.Kiegészítő táblázat) külön kutakhoz adtuk 2 db ml-1 koncentrációjú koncentrációban. Minden minta tartalmazott egy stimulálatlan (csak Média) vezérlést is. 16-18 órás inkubáció után 37 C-on, 5% CO2-val, a sejteket centrifugálással pelletáltuk (1800 r.p.m., 5 perc), és 200 CL felülúszót gyűjtöttünk be. Az S1 és S2 stimuláció felülúszóit kombináltuk és -80 CC-n tároltuk, amíg szükséges volt.

a Citokinválaszokat az MSD V-PLEX proinflammatorikus citokin (humán) Panel 1 Kit segítségével elemeztük, amelyet az MSD validált. Mindegyik lemezt kilenc különböző capture monoklonális antitest borítja kilenc különböző citokinnel szemben, amelyek független foltokban vannak elrendezve az egyes kutak alján. Az IFN-y, IL-1), az IL-2, az IL-4, az IL-8, az IL-10, Az IL-12p70, az IL-13 és a TNF -) citokinek Th1 – vagy Th2-típusú T-sejtválaszt eredményeztek.

a Felülúszókat 1:2 arányban hígítottuk a nem stimulált mintáknál és 1:10 arányban az S1 / S2 stimulált mintáknál az MSD 2 hígítóban. A készlet egy multi-analit liofilizált kalibrátor, hogy, amikor feloldjuk, fogják használni, mint a standard görbe egy négyszeres soros hígítás alkotnak egy nyolcpontos standard görbe bevont ki két példányban. A citokin méréseket a gyártó utasításai szerint végeztük. A lemezeket egy MSD-olvasón olvastuk az olvasási puffer hozzáadásától számított 15 percen belül.

az adatokat az MSD Discovery Workbench 4.0 segítségével elemeztük. A mintákat megismételtük, ha bármely minta 20% – nál nagyobb variációs együtthatóval rendelkezik. A replikációkat a standard görbéből leolvastuk, és megszoroztuk a hígítási tényezővel, és a koncentrációt a pg ml−1-ben megadott replikációk átlagaként jelentették. A stimulálatlan mintából származó koncentrációt a stimulált koncentrációból vontuk le (háttér kivonás). A háttérkivonások negatív értékeit nullák váltották fel. Tetszőleges értéke 0.0001-et adtunk a háttérkivonásokhoz az összes mintán, hogy legyőzzük a mintákból emelt null értékek jelenlétét, amelyek túl alacsonyak ahhoz, hogy le lehessen olvasni a standard görbéről.

Izotípus és alosztály standardizált ELISA

a chadox1 nCoV-19 és lábadozó plazmamintákkal beoltott résztvevők mintáit anti-spike IgG1, IgG3, IgA és IgM szempontjából vizsgáltuk. A MenACWY-val beoltott résztvevők mintáit csak anti-spike IgA és IgM antitestekre vizsgálták. Standardizált ELISA-t alkalmaztak a keringő SARS-CoV-2 tüske-specifikus IgG1, IgG3, IgA és IgM válaszok számszerűsítésére. A vizsgálat teljes módszertani részleteit korábban közzétették23. Röviden, az ELISA lemezeket egy éjszakán át 5 db ml−1-es SARS-CoV-2 Teljes hosszúságú tüskefehérjével vontuk be. A blokkoló kazein blokkolása után a PBS-ben (Thermo Fisher Scientific) A mintákat (minimum 1:50 hígítás) 2 órán át inkubáltuk 37 C-on, 300 r.p.m. rázással. A standard görbét és a belső kontrollokat referencia szérumból hozták létre, magas titerű donor szérumkészlet felhasználásával. Ezután alkalikus foszfatáz-konjugált másodlagos antitestet adtunk hozzá (a detektált immunglobulin alosztálytól vagy izotípustól függően), majd 1 órán át inkubáltuk 37 CC-n, 300 RPM rázással. A lemezeket pnpp alkalikus foszfatáz szubsztrát (Thermo Fisher Scientifc) alkalmazásával fejlesztették ki 1-4 órán át 37 CBC-n, 300 RPM rázással és 405 nm-en olvasva, amikor a belső kontroll elérte az OD405 1 értéket. A Plate pass / fail kritériumokat a ref. 23.

Izotípus és alosztály optikai sűrűség ELISA

antigén-specifikus IgG2, IgG4 és IgE válaszokat mutattak ki antigén-specifikus szérum kontroll hiányában optikai sűrűség (OD) ELISA-val. A vizsgálat részletes eljárásait korábban leírták23. Röviden, az ELISA lemezeket egyik napról a másikra bevontuk 5 db ml−1-es SARS-CoV-2 Teljes hosszúságú tüske fehérjével, plusz egy kereskedelmi humán immunglobulin kontroll a vizsgált antitest izotípus vagy alosztály számára. A PBS-ben lévő blokkoló kazeinnel történő blokkolást követően a vizsgálati minták és a pandémiát megelőző negatív kontrollok (legalább 1:50 hígítás) 2 órán át 37 db-os c-n, 300 r.p.m. rázással vontuk ki. Különböző alkalikus foszfatáz-konjugált szekunder antitesteket adtunk hozzá az immunglobulin izotípusától vagy alosztályától függően, amelyet 1 órán át vizsgálnak 37 CBC-n, 300 RPM rázással. A lemezeket pnpp alkalikus foszfatáz szubsztrát alkalmazásával fejlesztettük ki 1-4 órán át 37 CBC-n, 300 RPM rázással és 405 nm-en olvasva, amikor az immunglobulin kontroll elérte a meghatározott OD405-öt. A negatív határérték-számításokat a ref. 23.

aviditás ELISA

a 28.napon számszerűsíthető választ mutató önkéntesektől származó SARS-CoV-2 tüske-specifikus IgG aviditását értékelték. A donor szérum anti-SARS-CoV-2 tüske-specifikus teljes IgG antitest aviditását nátrium-tiocianát (NaSCN) – kiszorítású ELISA-val értékelték. A nunc MaxiSorp Elisa lemezeket (Thermo Fisher Scientific) egyik napról a másikra (16 óra) vontuk be 4 cc−nál, 50 CL / 2 db ml-1-es SARS-CoV-2 trimer spike protein PBS-ben hígítva. A lemezeket háromszor mossuk PBS/Tween (0,05%) (PBS/T), majd szárazra csapoljuk. A lemezeket 1 órán át blokkoltuk, a PBS-ben (Thermo Fisher Scientific) 100 blokklánc / kút blokkoló kazeinnel 20 C. A vizsgálati mintákat és a pozitív kontroll szérumkészletet blokkoló pufferben hígítottuk, hogy normalizáljuk őket OD405-re 1-re, és 50 blokkláncot adtak a lemez minden sorához két példányban (kivéve az utolsó sort, ahol csak blokkoló puffert adtak hozzá). A lemezeket 2 órán át inkubáltuk 20 CBC-n, majd háromszor PBS/T-vel mossuk, majd szárazra csapoljuk. A PBS-ben hígított NaSCN (Sigma-Aldrich) növekvő koncentrációját 50 db / lyukon adtuk a lemez minden egyes sorához (1 M, 2 M, 3 m, 4 m, 5 m és 6 M), kivéve az első és az utolsó sort, ahol csak PBS-t adtunk hozzá. A lemezeket 15 percig inkubáltuk 20 CC-n, majd hatszor PBS/T-vel mossuk, majd szárazra csapoljuk. A goat-ban előállított anti-humán IgG (anti-humán-lánc-specifikus) alkalikus foszfatáz antitestet (Sigma-Aldrich) blokkoló pufferben 1:1000 arányban hígítottuk, és a lemezhez kútonként 50 blokkláncot adtunk. A lemezeket 1 órán át inkubáltuk 20 CBC-n, majd háromszor PBS/T-vel mossuk, majd szárazra csapoljuk. Ezután a pnpp–alkalikus foszfatáz szubsztrát (Thermo Fisher Scientific) kútjánként 100-at adtak hozzá, és a lemezeket 20 CC-n inkubáltuk 405 nm-en (OD405) egy ELx808 abszorbanciaolvasóval (BioTek) mértük, amíg a kezeletlen mintakutak elérték az OD405 1-es értékét (0,8-2,0). Gen5 ELISA software v3.09 (BioTek) segítségével ábrázoltuk az OD405 vizsgálati mintát a NaSCN koncentrációjával szemben, és egy 0,001 simító tényezővel rendelkező spline függvényt illesztettünk az adatokhoz. Minden minta esetében az OD405 NaSCN nélküli értékének 50% – ára (IC50) csökkentéséhez szükséges NaSCN-koncentrációt interpolálták ebből a funkcióból, és az aviditás mértékeként jelentették.

Ex vivo IFN – ++ ELISpot vizsgálatok

az ELISpot vizsgálatokat frissen izolált Pbmc-kkel végezték a ChAdOx1 nCoV19 vakcinázás előtt és 14 d után, a korábban leírtak szerint7. A vizsgálatokat Multiscreen IP ELISpot lemezek (Millipore) alkalmazásával végeztük, és egy éjszakán át 4−nél bevontuk őket. C) 10 CBG ml-1 humán anti-IFN-XHamster bevonó antitest (klón 1-D1K, Mabtech) karbonátos pufferben, mielőtt háromszor mosnánk PBS-sel és blokkolnánk R10 közeggel 2-8 órán keresztül.ezután 2,5 XNUMX XNUMX Pbmc-t adtunk a lemez minden kútjához, 13 peptid−medencével együtt, amelyek lefedik a SARS-CoV-2 tüskefehérjét és az N-cov-2 tüskefehérjét terminális TPA leader-szekvencia 10 ml-1-es végső koncentrációban (3. kiegészítő táblázat). Mindegyik vizsgálatot három példányban végeztük, és 16-18 órán át inkubáltuk 37 CC-on, 5% CO2-vel.

a lemezeket ezután hatszor PBS/T−vel mosva fejlesztettük ki, majd 1-et adtunk hozzá ml-1 anti-IFN-antioxidánsok detektor antitest (7-B6-1-Biotin) mindegyik kúthoz. 2-4 órás inkubáció után a lemezeket ismét megmossuk, majd 1:1000 SA-ALP-t adunk hozzá 1-2 órán keresztül.

az ELISpot lemezeket egy AID automatizált ELISpot számlálóval (AID Diagnostika, C algoritmus) számoltuk, azonos beállításokat használva az összes lemezhez, a spot számokat pedig csak a műtárgyak eltávolítására állítottuk be. A válaszok átlaga a triplikált kutak között volt, és a nem stimulált (negatív kontroll) kutak átlagos válaszát kivonták. Az eredményeket SFC/106 PBMCs-ben fejezzük ki. A peptidre adott válaszok akkor tekinthetők pozitívnak, ha a háttérből kivont válaszok >40 SFU/106 Pbmc-k voltak. Ha a válaszok >80 SFC/106 Pbmc−k voltak a negatív kontroll kutakban (pbmc-k antigén nélkül) vagy <800 SFC/106 Pbmc−k a pozitív kontroll kutakban (összesített Sztafilokokkusz enterotoxin B 0,02 ml ml-1-nél és fitohaemagglutinin-L 10 ezer ml-nél-1), az eredményeket kizárták a további elemzésből.

ICS

az ICS-t frissen izolált pbmc-kkel végeztük, amelyeket összevont S1 és S2 peptidekkel stimuláltak. Ezután 3 db 106 db pbmc−t reszuszpendáltunk 5 ml Polipropilén FAC csövekbe 1 ml térfogatra R10 táptalajban, kiegészítve 1 db ml-1 anti-humán CD28-mal és CD49d-vel és 1 db 107a PE-Cy5-Tel (eBioscience). Az S1 és az S2 peptidkészleteket (3.Kiegészítő táblázat) 2 ml−1-es koncentrációban adtuk hozzá. Mindegyik minta tartalmazott egy pozitív kontrollt is (S. enterotoxin B 1 GB ml−1-nél; Sigma Aldrich) és egy nem stimulált (csak Média) kontrollt. A sejteket 37cc-on inkubáltuk, 5% CO2-val 16-20 óra alatt, a brefeldin A-t (3cl−g ml-1) és a monenzint (2 mM) (eBioscience) 2 óra

után adtuk hozzá az inkubáció végén, a sejteket FACS pufferben mostuk (0,1% szarvasmarha szérum albumint és 0,01% NaN3-ot tartalmazó PBS), és átvisszük egy 96-lyukú u-alsó szövettenyésztő lemezre festés céljából. Először egy felületfestő koktélt adtunk hozzá, amely 2,5 ezer köbméter 1:40 arányban hígított Aqua élő/halott foltot (Thermo Fisher Scientific) és 1 ezer köbméter BV711 CCR7-et (BioLegend) tartalmazott 46,5 ezer köbméter FACS pufferben. A sejteket sötétben inkubáltuk 20 percig, majd FACS pufferrel mossuk. Ezután minden egyes kúthoz 100 köbméter CytoFix/CytoPerm oldatot (BD Biosciences) adunk, majd további 20 percig inkubáljuk. A sejteket ezután Perm / Wash pufferrel mossuk az ICS előtt. Az ICS koktél foglalt 0.025 µl CD45RA BV605, 0.025 µl TNF-α PE-Cy7, 0.1 µl IFN-γ FITC, 0.025 µl CD14 e450, 0.025 µl CD19 e450, a 0,5 µl CD3 AF700, 1 µl IL-2 BV650, 1.25 µl IL-5 PE, 2.5 µl IL-13 APC, 3.5 µl CD4 PerCP Cy5.5 és 5 KB CD8 APC-eF780, a FACS pufferben hígított teljes térfogatra 50 ezer fő. A mintákat sötétben festettük 30 percig. A sejteket kétszer mostuk Perm / Wash pufferrel, kétszer pedig FACS pufferrel, mielőtt 100 kb 1% – os paraformaldehidben reszuszpendáltuk őket.

a kompenzációs kontrollokat minden tételhez frissen készítettük OneComp eBeads (eBioscience) alkalmazásával. A sejteket jégen tartották,és a megszerzés előtt egy 35-CGM-es szűrőn szűrték át. A sejteket egy ötlézeres BD LSRFortessa flow citométeren (BD Biosciences) szereztük FACSDiva v8.02 (BD Biosciences) alkalmazásával, és az adatokat flowjo v10-ben elemeztük.7. A minta elemzéséhez hierarchikus kapuzási stratégiát alkalmaztak (kiegészítő ábra. 7). Minőségellenőrzési eljárást alkalmaztak a 100 000-nél kevesebb eseményt tartalmazó minták eltávolítására az élő CD3+ gate-ből, valamint a <1% – os citokinválaszú minták eltávolítására az S. enterotoxin B-re (CD4+ és CD8+ IFN -+++, CD8+ TNF -+++). A kimutathatóság alsó határát alkalmazták, és csak azokat a mintákat vonták be az elemzésbe, amelyek ELISpot-válasza nagyobb volt, mint 200 SFC/106 Pbmc.

statisztikai elemzés

az összes statisztikai tesztet, valamint az adatok grafikus ábrázolását a GraphPad Prism 8.4.3-ban végeztük. Az adatokat médiaként mutatjuk be IQR-ekkel. Az adatok normalitásának ellenőrzésére d ‘ Agostino-Pearson teszteket használtunk. A párosítatlan mintákat Mann–Whitney U tesztekkel hasonlították össze, a párosított mintákat pedig a Wilcoxon teszttel hasonlították össze. Minden teszt Kétfarkú volt, összehasonlításonként 5%-os hibaaránnyal. A Bonferroni korrekciót a többszörös összehasonlítások korrigálására használták. A korrelációkat Spearman rangtesztjével elemeztük. A 0,05-nél kisebb P értékeket szignifikánsnak tekintették.

jelentés összefoglaló

a kutatás tervezésével kapcsolatos további információk a cikkhez kapcsolódó Nature Research Reporting összefoglalóban találhatók.

Vélemény, hozzászólás?

Az e-mail-címet nem tesszük közzé.