Système d’immunoessai à flux latéral multiplexé bicolore pour détecter de manière différentielle des espèces de paludisme humain sur une seule ligne de test

Principe de LFA bicolore dans la détection multiplexée d’antigènes du paludisme sur une seule ligne de test de la bande de LFA

Dans la LFA, lorsque le liquide d’échantillon est distribué sur un tampon d’échantillon et s’écoule vers le conjugué pad, les particules de latex bleu et rouge capturent respectivement les antigènes pLDH et PfHRP2. Les antigènes liés aux particules de latex sont ensuite transportés à travers la bandelette et sont détectés au niveau de la ligne de test où un mélange d’anticorps de détection contre (pan) pLDH et PfHRP2 sont fonctionnalisés (Fig. 1). Le changement des profils de couleur développés sur la région d’essai correspond au nombre de particules de latex bleu et rouge capturées.

La performance du LFA bicolore a d’abord été démontrée en détectant des antigènes malariques recombinants dopés dans le tampon de lavage à différentes concentrations. Trois scénarios de diagnostic différents ont été testés: pLDH uniquement, PfHRP2 uniquement et infection simultanée pLDH-PfHRP2. Pour la co-détection, le pLDH et le PfHRP2 ont été mélangés à un rapport molaire de 1 à 6, pour imiter des échantillons cliniques d’infection à P. falciparum. Quinze minutes après la distribution de l’échantillon suivie d’un lavage tampon, les profils de couleur sur les régions d’essai ont été enregistrés. Lorsque l’échantillon ne contenait que du pLDH, des lignes de test bleues ont été observées (Fig. 2 bis). Lors de la détection simultanée, la région d’essai a montré une couleur de mélange de bleu et de rouge (Fig. 2b). Pour les échantillons PfHRP2 uniquement, les lignes de test sont devenues rouges (Fig. 2c). Les lignes de contrôle sur toutes les bandes de LFA présentaient une couleur de mélange de bleu et de rouge, indiquant que des particules de latex rouges et bleues étaient transportées à travers les bandes.

Fig. 2
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Bandelettes de test représentatives de la LFA bicolore. Des couleurs distinctes ont été observées au niveau des lignes de test, correspondant à un type d’antigènes, telles qu’une ligne de test bleue pour la détection du pLDH uniquement, une couleur de mélange des lignes de test pour la détection simultanée et une ligne de test c rouge pour la détection du PfHRP2 uniquement. La couleur du mélange au niveau des lignes témoins indique que les particules de latex rouge et bleu ont migré sur toute la longueur de la bande

Caractéristiques des profils de couleur des bandes de LFA

Pour mettre en œuvre la méthode quantitative et qualitative dans le test, les profils d’intensité des bandes de LFA ont été analysés. Les images des bandes ont été acquises à l’aide d’une caméra arrière de 8 mégapixels d’un iPad Air 2 dans les mêmes conditions d’éclairage LED blanc. La distance entre la ligne de test et la ligne de contrôle était d’environ 200 pixels et la largeur de la ligne était d’environ 50 pixels dans les images. Pour obtenir les profils de couleurs RVB, les images ont été ouvertes à l’aide du logiciel ImageJ et ont exécuté la commande « Color Profiler”. Pour simplifier, seuls les profils d’intensité rouge et bleu ont été analysés, car les profils d’intensité verte n’affectaient pas de manière significative la discrimination des couleurs rouge et bleue et fournissaient une valeur auxiliaire dans les images en couleur. La membrane de nitrocellulose de la bandelette réactive était blanche, ce qui entraînait des intensités de fond élevées. Les couleurs avec contraste sur les lignes de test et de contrôle ont généré les pics décomposés des intensités de fond (Fig. 3).

Fig. 3
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Profils d’intensité rouge et bleu des bandelettes réactives. Les profils de couleurs RVB ont été obtenus à partir des images en bandes de la Fig. 2. Pour plus de simplicité, les intensités rouges et bleues ont été représentées, à l’exception de l’intensité verte. a Lorsque des couleurs bleues sont apparues sur les lignes d’essai, l’intensité rouge était plus dégradée que l’intensité bleue. Cette tendance était due au fait que l’arrière-plan de la bande blanche conservait des valeurs RVB élevées. b Lorsque la couleur du mélange est apparue sur les lignes d’essai, des pics rouges et bleus ont été générés correspondant à la concentration d’antigènes. c Pour la détection de PfHRP2 uniquement, les pics bleus étaient plus dégradés que les pics rouges, en observation inverse à partir d’un

Deux caractéristiques intrigantes dans les profils de couleurs ont été observées. Tout d’abord, lorsque les lignes de test bleues sont apparues sur les bandes, les pics d’intensité rouges étaient plus dégradés que les pics bleus dans les profils de couleur. En effet, la couleur bleue a conservé des valeurs de pixels bleus relativement plus élevées que les valeurs rouges. La figure 3 montre les profils d’intensité rouge et bleu des bandes extraites des images de la Fig. 2. Pour la détection de pLDH uniquement lorsque de fortes raies d’essai bleues ont été observées, les intensités rouges se sont considérablement dégradées par rapport aux intensités de fond supérieures, plus que les pics bleus (Fig. 3 bis). Dans le même contexte, la détection PfHRP2 avec des lignes de test rouges apparentes dans les images a généré les pics bleus inférieurs aux pics rouges (Fig. 3c).

L’autre caractéristique des profils de couleur était les pics de couleur non spécifiques de la Fig. 3a (intensité bleue) et Fig. 3c (intensité rouge) qui n’étaient pas associées au développement de la couleur par les particules de latex. La liaison non spécifique ou la réactivité croisée sur les lignes d’essai n’ont pas été observées à l’œil nu. En effet, Fig. 2 a montré une distinction claire des couleurs pour chaque mode de détection. Cependant, les pics d’intensité non spécifiques ont été développés par le contraste de l’image. Au fur et à mesure que les particules de latex s’accumulaient sur les lignes de test, l’obscurité augmentait, entraînant une diminution des valeurs RVB. Ainsi, tous les pics d’intensité de la Fig. 3 ne provenaient pas des couleurs pures mais étaient affectées par le contraste de l’image. Il n’était pas facile de découpler le contraste et la couleur pure des images. Cependant, une fonction de corrélation simple a été établie en calculant le rapport des zones de désintégration rouge/ bleu pour discriminer le type de couleur. Cela a été abordé et est discuté dans la section suivante.

Limite de détection et limite de distinction de couleur

Pour analyser plus avant les bandes, éviter la subjectivité et confirmer la limite visuelle de détection, les zones de désintégration des pics rouges et bleus ont été calculées à partir de la Fig. 3. Pour calculer les zones de crête, l’alignement de crête a d’abord été effectué sur l’intensité de fond. Et puis la règle des 3/8 de Simpson a été appliquée aux pics alignés pour l’intégration numérique pour calculer les aires.

Les graphiques résultants de la Fig. 4 a montré les zones de pics rouges et bleus aux lignes de test en fonction des concentrations d’antigènes de trois expériences indépendantes. Les zones de désintégration rouge et bleue augmentaient avec l’augmentation des concentrations d’antigènes. Cependant, les degrés de zones de désintégration dépendent du type de couleurs développées sur les lignes d’essai. Pour les échantillons de pLDH uniquement, les zones de désintégration rouges étaient plus élevées que les zones bleues (Fig. 4a), alors que seuls les échantillons PfHRP2 présentaient la tendance inverse (Fig. 4c). Pour valider l’efficacité du test, la limite de détection (LoD) a été estimée en adoptant une approche standard définie comme une moyenne plus trois fois l’écart type (Snon-target + 3SD) du signal d’échantillon vierge. La LoD à laquelle tous les signaux rouges et bleus se distinguaient des signaux d’échantillons vierges a été estimée à 31,2 ng mL-1 dans tous les scénarios de détection (figures insérées dans la Fig. 4).

Fig. 4
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Calcul des zones de désintégration rouge et bleue sur les lignes de test. Les zones de désintégration rouge et bleue ont été calculées à partir de la Fig. 3 pour une détection pLDH uniquement, b détection simultanée pLDH et PfHRP2 et c détection PfHRP2 uniquement. Les différents degrés de zones de désintégration entre les intensités rouge et bleue ont été observés en fonction des types d’échantillons et des concentrations. Les graphiques insérés ont été zoomés à des concentrations plus faibles. La LoD à distinguer des échantillons non ciblés était de 31,2 ng mL-1 pour tous les modes de détection. Les barres d’erreur indiquent des écarts-types par rapport aux expériences triples

Ensuite, le rapport des zones de désintégration du rouge au bleu a été calculé pour fournir une méthode simple de discrimination des couleurs (Fig. 5). Comme prévu, les rapports de désintégration ont augmenté avec l’augmentation des concentrations de pLDH qui attribuaient des intensités de couleur rouge (courbe supérieure de la Fig. 5). La région au-dessus de la courbe bleue supérieure est la seule région du pLDH, indiquant P. falciparum négatif.

Fig. 5
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Rapports des zones de désintégration rouge/bleue. La fonction simple des rapports de couleur calculés à partir de la Fig. 4 a fourni un critère pour discriminer les couleurs en fonction des concentrations de l’échantillon. La courbe bleue avec des fabricants de cercles était au-dessus des autres courbes, indiquant des couleurs bleues fortes. Pour la courbe bleue, les concentrations de pLDH ont été indiquées dans l’axe des abscisses. La courbe du milieu avec des marqueurs en losange était une courbe intermédiaire entre les courbes du haut et du bas, et représentait les couleurs mélangées de rouge et de bleu. Pour la courbe médiane, les concentrations de PfHRP2 ont été indiquées dans l’axe des abscisses, et pLDH/PfHRP2 a été mélangé au rapport de 1:6. La courbe du bas indiquait les fortes couleurs rouges. Pour la courbe rouge, les concentrations de PfHRP2 ont été indiquées dans l’axe des abscisses. Les flèches du graphique inséré indiquaient la limite de distinction des couleurs à partir de laquelle les couleurs bleues se distinguaient des couleurs rouges. Les barres d’erreur sont des écarts types par rapport à des expériences triples

En revanche, les valeurs du rapport ont diminué avec l’augmentation des concentrations de PfHRP2 (courbe inférieure de la Fig. 5). La région sous la courbe rouge inférieure contient uniquement PfHRP2. La pLDH étant spécifique à la pan, elle devrait toujours être présente pour les cas positifs au paludisme. Pour les quatre espèces humaines de paludisme, le résultat ne tombera pas uniquement dans la région PfHRP2.

Les rapports de décroissance dans la détection simultanée étaient intermédiaires et compris entre la courbe supérieure et la courbe inférieure de la Fig. 5, indiquant qu’il devrait s’agir d’une couleur de mélange de bleu et de rouge. La région entre la courbe bleue supérieure et la courbe rouge inférieure contient à la fois pLDH et PfHRP2, ce qui indique que P. falciparum est positif.

La limite de distinction des couleurs où les couleurs rouge et bleue étaient distinguables en utilisant la même définition de LoD a été estimée. On peut observer que la courbe supérieure de la Fig. 5 était toujours supérieure aux valeurs plus 3SD de la courbe inférieure après 7,8 mg mL-1, fixées comme limite de distinction de couleur (figure insérée dans la Fig. 5).

Validation de la LFA bicolore en testant des échantillons cliniques

Pour les 15 échantillons négatifs testés, les intensités de couleur sont inférieures à la LoD pour la pLDH et la PfHRP2 et sont donc considérées comme négatives pour le paludisme. Pour distinguer les types d’infection et estimer les concentrations d’antigènes pour les 10 échantillons positifs au paludisme, la discrimination des couleurs a été réalisée avec les valeurs RVB de l’analyse ImageJ. Étant donné que la pLDH est spécifique au pan et se lie à toutes les espèces de paludisme, la présence de la pLDH peut être attendue dans tous les échantillons positifs au paludisme. La concentration de pLDH peut être estimée par ses zones de désintégration rouge correspondantes avec la courbe d’étalonnage de la Fig. 4. Pour tous les échantillons positifs au paludisme, une méthode d’essai et d’erreur en quatre étapes a été adoptée pour déterminer si l’échantillon est P. falciparum ou non P. falciparum (p. ex., P. vivax, P. ovale ou P. malariae).

  • Étape 1: ImageJ est utilisé pour calculer les zones de désintégration rouge et bleue pour la ligne de test, puis le rapport des zones de désintégration rouge sur bleue a été calculé et défini comme ratio_cal.

  • Étape 2: Puisque la pLDH est présente dans tous les échantillons cliniques positifs, supposons que l’échantillon contient uniquement de la pLDH et corrélez les zones de désintégration rouge mesurées à l’étape 1 avec les concentrations de pLDH, avec la courbe d’étalonnage de la Fig. 4a.

  • Étape 3: Trouvez la valeur du rapport des zones de désintégration rouge / bleue (axe y) sur la courbe bleue supérieure de la Fig. 5 à la concentration de pLDH calculée (à partir de l’étape 2), et définissez-la comme ratio_ref.

  • Étape 4: consistera en deux scénarios: (1) Si ratio_cal ≥ ratio_ref, alors l’échantillon tombe dans la région au-dessus de la courbe bleue supérieure de la Fig. 5 (région pLDH uniquement), indiquant non-P. falciparum, mais positif au paludisme (P. vivax, P. ovale ou P. malariae). Dans ce scénario, les concentrations estimées de pLDH de l’étape 2 sont valides puisque les échantillons contiennent uniquement de pLDH; (2) Si ratio_cal < ratio_ref, alors l’échantillon tombe dans la région entre la courbe bleue supérieure et la courbe rouge inférieure de la Fig. 5 (région pLDH + PfHRP2), indiquant que P. falciparum est positif. Dans ce scénario, les concentrations estimées de pLDH de l’étape 2 ne sont pas valides puisque les échantillons contiennent du pLDH et du PfHRP2, et la courbe d’étalonnage de la Fig. 4a ne peut pas être appliqué. L’interprétation de la couleur du mélange était compliquée et peut-être biaisée par le contraste de l’image. Il n’a pas non plus été facile de créer des courbes standard pouvant couvrir tous les scénarios de combinaisons de couleurs.

Les zones de désintégration rouge et bleue et les rapports de couleur des échantillons positifs de P. falciparum et de P. vivax ont été présentés dans les tableaux 1 et 2, respectivement.

Tableau 1 Résultats de l’analyse d’images, et estimation des concentrations d’antigènes et du type d’infection palustre à partir d’échantillons cliniques positifs de Plasmodium falciparum
Tableau 2 Résultats de l’analyse d’images, et estimation des concentrations d’antigènes et du type d’infection paludique à partir d’échantillons cliniques de Plasmodium vivax

Comme indiqué dans le tableau 1, les 5 échantillons ont été confirmés positifs à P. falciparum par examen microscopique. En utilisant la méthode d’essai et d’erreur en quatre étapes illustrée ci-dessus, le rapport de référence rouge/bleu (ratio_ref) a été estimé à la zone de désintégration rouge correspondante par les courbes d’étalonnage pLDH et comparé au rapport rouge/bleu des échantillons cliniques (ratio_cal). Puisque ratio_cal <ratio_ref pour tous les 5 échantillons énumérés dans le tableau 1, tous les échantillons tombent dans le scénario deux de l’étape 4 comme décrit ci-dessus. On pourrait alors conclure que l’échantillon est positif à P. falciparum. Par exemple, l’échantillon n° 25 est confirmé comme positif à P. falciparum par microscopie. La zone de désintégration rouge et la zone de désintégration bleue à la ligne d’essai sont respectivement de 917,11 et 499,20. Le rapport rouge/bleu de l’échantillon n° 25 (ratio_cal) est donc de 1,84. Le rapport de référence rouge/bleu au niveau de la zone de désintégration rouge correspondante (917.11) (ratio_ref) est calculé par la courbe d’étalonnage pLDH de la Fig. 4a, et la valeur est de 1,95. Puisque 1,95 (ratio_ref) > 1,84 (ratio_cal), alors l’échantillon n°25 est confirmé comme positif à P. falciparum par discrimination de couleur LFA. Ceci est en accord avec les résultats de microscopie et d’ELISA.

Comme le montre le tableau 2, les 5 échantillons ont été confirmés comme P. vivax positif par examen microscopique. De même, ratio_ref et ratio_cal ont été obtenus. Étant donné que ratio_cal >ratio_ref pour les 5 échantillons énumérés dans le tableau 2, tous les échantillons tombent dans la seule région de la pLDH, indiquant un paludisme positif mais négatif pour P. falciparum. Dans ce cas, la courbe d’étalonnage pLDH de la Fig. 4a pourrait être appliqué pour obtenir les concentrations de pLDH pour tous les échantillons du tableau 2. Par exemple, l’échantillon n° 471 est confirmé comme positif à P. vivax par microscopie. La zone de désintégration rouge et la zone de désintégration bleue à la ligne d’essai sont respectivement de 631,10 et 299,22. Le rapport rouge/bleu de l’échantillon n° 471 (ratio_cal) est donc de 2,11. Le rapport de référence rouge sur bleu au niveau de la zone de désintégration rouge correspondante (631.10) (ratio_ref) est calculé par la courbe d’étalonnage pLDH de la Fig. 4a, et la valeur est 1,63. Depuis 2,11 (ratio_cal) > 1,63 (ratio_ ref), l’échantillon n°471 est confirmé comme positif au paludisme mais P. falciparum négatif par discrimination de couleur de la LFA. Ceci est en accord avec les résultats de microscopie et d’ELISA.

Pour tous les échantillons du tableau 2, il convient de noter que les résultats de quantification du pLDH ont montré une discordance entre les méthodes LFA et ELISA. La concentration estimée en LFA était inférieure à celle de l’ELISA. Cette erreur pourrait être attribuée à la différence des courbes standard pour l’échantillon clinique de tampon et de sang total. Il convient également de noter pour l’échantillon no 486 que les concentrations de PfHRP2 avec les méthodes LFA et ELISA sont de 0 et 3,35 ng mL−1, respectivement, puisque 3,35 ng mL−1 est déjà au-delà de la LoD de LFA pour la détection de PfHRP2.

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