rapid Oxidation of Kysteine to Kystine in Aqueous Solutions-Implications for spended Media Analysis

Download this note (PDF)

Kysteine oxidation in cell culture media

Cell culture media typically provide all the amino acids necessary for cell to grow. Rajoitukset yhdessä tai useammassa aminohapossa eivät ainoastaan johda soluviljelmien suboptimaaliseen kasvuun, vaan myös vaikuttavat negatiivisesti tuotteen saantoon ja laatuun. Prosessin kehityksen aikana käytetty väliaine-analyysi auttaa seuraamaan aminohappopitoisuuksia ja määrittämään kulutusnopeuksia tällaisten rajoitusten havaitsemiseksi ja välttämiseksi.

Tämä on erityisen haastavaa kysteiinin tapauksessa, sillä se hapettuu helposti muodostaen kystiinin, kahden kysteiinimolekyylin dimeerin, joka on yhteydessä toisiinsa disulfidisillan kautta. Äskettäin, paperi omistettu lämpötila ja varastointi stabiilisuus soluviljelmän myös raportoitu aminohappo kysteiini on erityisen epävakaa testatuissa olosuhteissa (Krattenmacher et al., 2018). Tämä on kokemuksemme mukaista, sillä usein mittaamme kysteiinin jäämiä tai jäämiä, kun taas kystiini – sen hapettunut muoto – havaitaan selvästi. Teimme kokeita, joissa tutkittiin kysteiinin ja kystiinin redox-käyttäytymistä vedessä, pitäen mielessä, että monimutkaisemmat olosuhteet, jotka löytyvät (käytetyistä) soluviljelmistä, saattavat helpottaa monimutkaisempaa kemiaa.

kysteiinin muuntaminen kystiiniksi vedessä

saadaksemme lisätietoa kysteiinin (in-)säilyvyydestä valmistimme 1 mM liuoksen veteen, säilytimme sitä huoneenlämmössä ja otimme näytteitä eri ajankohtina. Otimme useita näytteitä 26 tunnin aikana ja sitten” pitkän aikavälin ” näytteen 6 päivän kuluttua. Jokainen näyte johdettiin suoraan näytteenoton jälkeen ja mitattiin patentoidulla aminohappoanalyysigradientillamme Agilent 1290 UHPLC-DAD-järjestelmällä. 0,5 mM: n kystiiniliuosta käsiteltiin samalla tavalla ja se toimi kontrollina.

kuten taulukosta 1 ja kuvasta 1 käy ilmi, jopa näyte vastavalmistetusta kysteiiniliuoksesta (0 h) sisälsi havaittavissa olevia määriä kystiiniä. Jo 11% aminohaposta oli aluksi dimeerin muodossa. Tämä arvo oli melko vakaa ensimmäiset tunnit, mahdollisesti siksi, että kysteiini sisälsi jonkin verran kystiiniä jo ennen liuottamista. 24 tunnin kuluttua enemmän kysteiiniä oli siirtynyt kohti kystiiniä, jolloin tuloksena oli 65% kysteiiniä ja 35% kystiiniä. 6 päivän kuluttua 98% kysteiinistä oli muuttunut kystiiniksi (kuva 2).

toisin kuin kysteiinin, kystiinin todettiin olevan stabiili liuoksessa. Sen pitoisuus pysyi vakiona, eikä yhdessäkään kontrollinäytteessä havaittu kysteiiniä (KS.Taulukko 2, Kuva 1+2).

edellä kuvattujen mittausten lisäksi kysteiini-ja kystiiniliuosten alikiintiöitä käsiteltiin DTT: llä (ditiotreitoli) tai TCEP: llä (tris(2-karboksietyyli)fosfiini), kahdella yleisellä pelkistävällä aineella. Kuten taulukoissa 3-6 esitetään, molemmat reagenssit suojelivat kysteiiniä hapettumiselta kystiiniksi ja jopa pelkistivät kystiinin vapaaksi kysteiiniksi lähes kokonaan. TCEP: n alentavat vaikutukset olivat voimakkaampia kuin DTT: n.

johtopäätös

kysteiini on yleinen soluviljelyaineen aineosa, mutta sitä ei usein havaita käytettyjen elatusaineiden näytteistä, koska se on epästabiili vesiliuoksissa. Tässä muistiossa kuvattu koe osoittaa, että kysteiini hapettuu pääasiassa kystiiniksi. Kysteiinin hapettuminen kystiiniksi tarkoittaa myös sitä, että kysteiiniä ja kystiiniä ei pitäisi sisällyttää samaan standardiseokseen. Sen sijaan yksittäisiä kysteiinistandardeja voitiin valmistaa ja suojata hapettumiselta TCEP: n avulla.

lisäksi havaitsimme kysteiinin hapettumisen etenevän vielä nopeammin soluviljelyaineissa, joihin oli lisätty kysteiiniä (tietoja ei näy). Tämä on otettava huomioon, kun potentiaalisia aminohapporajoituksia analysoidaan käytetyn median analyysillä. Siksi on tärkeää, että käytössä on asianmukaiset kvantitointimenetelmät.

mukaan lukien kysteiini ja kystiini, aminohappoanalyysimenetelmämme antaa kvantitatiivisia tuloksia kaikille proteinogeenisille aminohapoille sekä etanoliamiinille, sitrulliinille, hydroksiproliinille, ornitiinille ja tauriinille. Ota yhteyttä ja pyydä lisätietoja ja testaa sitä.

nopea ja luotettava aminohappoanalyysi

taulukot ja luvut

Tab. 1

välilehti. 1: suhteelliset määrät (rel. Amt.) kysteiinin ja kystiinin vasta valmistetussa 1 mM kysteiinissä vedessä, mitattuna UHPLC-DAD: llä derivoinnin jälkeen. Näytteenottoaika on esitetty tunteina / päivinä valmistamisen jälkeen.

Tab. 2

Tab. 2: suhteelliset määrät (rel. Amt.) kysteiinin ja kystiinin vasta valmistetussa 0, 5 mM kystiinissä vedessä, mitattuna UHPLC-DAD: llä johdannaisten jälkeen. Näytteenottoaika on esitetty tunteina / päivinä valmistamisen jälkeen.

Tab. 3

välilehti. 3: suhteelliset määrät (rel. Amt.) kysteiinin ja kystiinin vasta valmistetussa 1 mM kysteiini plus 0,5 mM DTT vedessä, mitattuna UHPLC-DAD: llä johdannaisten jälkeen. Näytteenottoaika on esitetty tunteina / päivinä valmistamisen jälkeen.

Tab. 4

välilehti.4: suhteelliset määrät (rel. Amt.) kysteiinin ja kystiinin vasta valmistetussa 1 mM kysteiini plus 0, 5 mM TCEP vedessä, mitattuna UHPLC-DAD: llä johdannaisten jälkeen. Näytteenottoaika on esitetty tunteina / päivinä valmistamisen jälkeen.

Tab. 5

Tab.5: suhteelliset määrät (rel. Amt.) kysteiinin ja kystiinin vasta valmistetussa 0,5 mM kystiinissä ja 0,5 mM DTT: ssä vedessä, mitattuna UHPLC-DAD: llä derivoinnin jälkeen. Näytteenottoaika on esitetty tunteina / päivinä valmistamisen jälkeen.

Tab. 6

Tab.6: suhteelliset määrät (rel. Amt.) kysteiinin ja kystiinin vasta valmistetussa 0, 5 mM kystiinissä ja 0, 5 mM TCEP: ssä vedessä, mitattuna UHPLC-DAD: llä johdannaisten jälkeen. Näytteenottoaika on esitetty tunteina / päivinä valmistamisen jälkeen.

Fig. 1

kuva. 1: Kysteiini / kystiini-mittaukset 0H liuosten valmistamisen jälkeen. Ensimmäisessä ruudussa näytetään mittaukset ilman pelkistintä, toisessa ruudussa DTT-vähennys ja kolmannessa ruudussa TCEP-vähennys. Näytetään UHPLC-DAD-kromatogrammit, joissa keskitytään derivoinnin jälkeen mitattuihin kysteiini-ja kystiinipiikkeihin.

Fig. 2

kuva. 2: kysteiini/kystiini mittaukset 6d valmistuksen jälkeen liuokset. Ensimmäisessä ruudussa näytetään mittaukset ilman pelkistintä, toisessa ruudussa DTT-vähennys ja kolmannessa ruudussa TCEP-vähennys. Näytetään UHPLC-DAD-kromatogrammit, joissa keskitytään derivoinnin jälkeen mitattuihin kysteiini-ja kystiinipiikkeihin.

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.