Un sistema de inmunoensayo de flujo lateral multiplexado de dos colores para detectar diferencialmente especies de malaria humanas en una sola línea de prueba

Principio de LFA bicolor en la detección multiplexada de antígenos de malaria en una sola línea de prueba de la tira de LFA

En el LFA, cuando el líquido de muestra se dispensa en una almohadilla de muestra y fluye al conjugado pad, las partículas de látex azul y rojo capturan antígenos pLDH y PfHRP2, respectivamente. Los antígenos unidos a las partículas de látex se transportan posteriormente a través de la tira y se detectan en la línea de prueba, donde se funcionalizan una mezcla de anticuerpos de detección para (pan)pLDH y PfHRP2 (Fig. 1). El cambio en los perfiles de color desarrollados en la región de prueba corresponde al número de partículas de látex azules y rojas capturadas.

El rendimiento de la LFA bicolor se demostró primero detectando antígenos de malaria recombinantes enriquecidos en el tampón de lavado a diversas concentraciones. Se probaron tres escenarios de diagnóstico diferentes: Solo pLDH, solo PfHRP2 e infección concurrente de pLDH-PfHRP2. Para la detección conjunta, se mezclaron pLDH y PfHRP2 en una proporción molar de 1 a 6, para imitar muestras clínicas de infección por P. falciparum . Quince minutos después de la dispensación de la muestra, seguida de un lavado tampón, se registraron los perfiles de color en las regiones de prueba. Cuando la muestra contenía solamente pLDH, se observaron líneas azules de prueba (Fig. 2a). En la detección simultánea, la región de prueba mostró un color de mezcla de azul y rojo (Fig. 2b). Para muestras de PfHRP2 solamente, las líneas de prueba se volvieron rojas (Fig. 2c). Las líneas de control en todas las tiras de LFA mostraron un color de mezcla de azul y rojo, lo que indica que las partículas de látex rojas y azules se transportaron a través de las tiras.

Fig. 2
figura 2

Tiras reactivas representativas del AFL bicolor. Se observaron colores distintos en las líneas de prueba, correspondientes a un tipo de antígenos, como las líneas de prueba azules a para la detección de pLDH únicamente, el color de mezcla b de las líneas de prueba para la detección simultánea y las líneas de prueba rojas c para la detección de PfHRP2 únicamente. El color de la mezcla en las líneas de control indicó que las partículas de látex rojo y azul migraron a lo largo de la tira

Características en los perfiles de color de las tiras de LFA

Para implementar el método cuantitativo y cualitativo en el ensayo, se analizaron los perfiles de intensidad de las tiras de LFA. Las imágenes de las tiras se adquirieron utilizando una cámara trasera de 8 megapíxeles de un iPad Air 2 bajo las mismas condiciones de iluminación LED blanca. La distancia entre la línea de prueba y la línea de control era de unos 200 píxeles, y el ancho de la línea era de unos 50 píxeles en las imágenes. Para obtener los perfiles de color RGB, las imágenes se abrieron utilizando el software ImageJ y ejecutaron el comando «Perfilador de color». Para simplificar, solo se analizaron los perfiles de intensidad de rojo y azul, ya que los perfiles de intensidad de verde no afectaron significativamente a la discriminación de color rojo y azul, y proporcionaron un valor auxiliar en las imágenes en color. La membrana de nitrocelulosa de la tira de prueba era blanca, lo que producía intensidades de fondo altas. Los colores con contraste en las líneas de prueba y control generaron los picos degradados por las intensidades de fondo (Fig. 3).

Fig. 3
figura 3

Perfiles de intensidad rojos y azules de tiras reactivas. Los perfiles de color RGB se obtuvieron de las imágenes de tira de la Fig. 2. Para simplificar, se representaron intensidades rojas y azules, excepto la intensidad verde. a Cuando los colores azules aparecieron en las líneas de prueba, la intensidad roja se deterioró más que la intensidad azul. Esta tendencia se debió a que el fondo de la tira blanca conservaba altos valores RGB. b Cuando el color de la mezcla apareció en las líneas de prueba, se generaron picos rojos y azules correspondientes a la concentración de antígenos. c Solo para la detección de PfHRP2, los picos azules estaban más deteriorados que los rojos, en observación inversa desde

Se observaron dos características intrigantes en los perfiles de color. En primer lugar, cuando las líneas de prueba azules aparecieron en las tiras, los picos de intensidad rojos estaban más deteriorados que los picos azules en los perfiles de color. Esto se debe a que el color azul retuvo valores de píxeles azules relativamente más altos que los valores rojos. La Figura 3 muestra los perfiles de intensidad rojos y azules de las tiras extraídas de las imágenes de la Fig. 2. Para la detección de pLDH solo donde se observaron fuertes líneas de prueba azules, las intensidades rojas se deterioraron significativamente de las intensidades de fondo superior, más que los picos azules (Fig. 3a). En el mismo contexto, la detección de PfHRP2 con líneas de prueba rojas aparentes en las imágenes generó los picos azules más bajos que los picos rojos (Fig. 3c).

La otra característica de los perfiles de color fueron los picos de color no específicos de la Fig. 3a (intensidad azul) y Fig. 3c (intensidad roja) que no se asociaron con el desarrollo de color por partículas de látex. La unión inespecífica o la reactividad cruzada en las líneas de ensayo no se observaron a simple vista. De hecho, Fig. 2 mostró una clara distinción de colores para cada modo de detección. Sin embargo, los picos de intensidad no específicos fueron desarrollados por el contraste de la imagen. A medida que las partículas de látex se acumulaban en las líneas de prueba, la oscuridad aumentaba, lo que resultaba en una disminución de los valores RGB. Por lo tanto, todos los picos de intensidad en la Fig. 3 no eran de los colores puros, pero se vieron afectados por el contraste de la imagen. No fue fácil disociar el contraste y el color puro de las imágenes. Sin embargo, se estableció una función de correlación simple calculando la relación de las áreas de decaimiento rojo a azul para discriminar el tipo de color. Esto se abordó y se analiza en la siguiente sección.

Límite de detección y límite de distinción de color

Para analizar más a fondo las tiras, evitar la subjetividad y confirmar el límite visual de detección, se calcularon a partir de la Fig. 3. Para calcular las áreas de picos, la alineación de picos se realizó primero en la intensidad de fondo. Y luego se aplicó la regla 3/8 de Simpson a los picos alineados para la integración numérica para calcular áreas.

Los gráficos resultantes de la Fig. 4 mostró las áreas de picos rojos y azules en las líneas de prueba en función de las concentraciones de antígenos de tres experimentos independientes. Las áreas de desintegración roja y azul aumentaron con el aumento de las concentraciones de antígenos. Sin embargo, los grados de las áreas de decaimiento dependen del tipo de colores desarrollados en las líneas de prueba. Para las muestras de pLDH solamente, las áreas de descomposición rojas fueron más altas que las azules (Fig. 4a), mientras que las muestras de PfHRP2 solo mostraron la tendencia opuesta (Fig. 4c). Para validar la eficacia del ensayo, se estimó el límite de detección (LoD) adoptando un enfoque estándar definido como una media más tres veces la desviación estándar (Snon-objetivo + 3SD) de la señal de muestra en blanco. El LD en el que se distinguían todas las señales rojas y azules de las señales de muestra en blanco se estimó en 31,2 ng mL−1 en todos los escenarios de detección (figuras insertadas en la Fig. 4).

Fig. 4
figura 4

Cálculo de las áreas de decaimiento rojas y azules en las líneas de prueba. Las áreas de decaimiento rojo y azul se calcularon a partir de la Fig. 3 para una detección de pLDH solamente, b detección simultánea de pLDH y PfHRP2, y c detección de PfHRP2 solamente. Los diferentes grados de áreas de desintegración entre las intensidades de rojo y azul se observaron en función de los tipos y concentraciones de muestras. Los gráficos insertados se ampliaron a concentraciones más bajas. El LD a distinguir de las muestras no objetivo fue de 31,2 ng mL-1 para todos los modos de detección. Las barras de error indican desviaciones estándar de experimentos triplicados

A continuación, se calculó la relación de áreas de desintegración del rojo al azul para proporcionar un método simple de discriminación de color (Fig. 5). Como era de esperar, las relaciones de decaimiento aumentaron con el aumento de las concentraciones de pLDH que atribuían intensidades de color rojo (curva superior en la Fig. 5). La región por encima de la curva azul superior es la única región pLDH, lo que indica P. falciparum negativo.

Fig. 5
figura 5

las Proporciones de rojo a azul caries áreas. La función simple de las relaciones de color calculadas a partir de la Fig. 4 proporcionó un criterio para discriminar los colores en función de las concentraciones de la muestra. La curva azul con círculos estaba por encima de las otras curvas, lo que indica colores azules fuertes. Para la curva azul, las concentraciones de pLDH se mostraron en el eje x. La curva media con marcadores de diamante era una curva intermedia entre las curvas superior e inferior, y representaba la mezcla de colores rojo y azul. Para la curva media, las concentraciones de PfHRP2 se mostraron en el eje x, y pLDH/PfHRP2 se mezcló en la proporción de 1:6. La curva inferior indicaba los fuertes colores rojos. Para la curva roja, las concentraciones de PfHRP2 se mostraron en el eje x. Las flechas en el gráfico insertado mostraban el límite de distinción de color del que se distinguían los colores azules de los rojos. Las barras de error son desviaciones estándar de experimentos triplicados

Por el contrario, los valores de la relación disminuyeron al aumentar las concentraciones de PfHRP2 (curva inferior en la Fig. 5). La región debajo de la curva roja inferior contiene solo PfHRP2. Dado que el pLDH es específico para cada región, siempre debe estar presente en los casos positivos de malaria. Para las cuatro especies de malaria humana, el resultado no caerá solo en la región del PfHRP2.

Las relaciones de decaimiento en la detección simultánea fueron intermedias e incluidas entre la curva superior y la curva inferior en la Fig. 5, indicando que debe ser una mezcla de color azul y rojo. La región entre la curva azul superior y la curva roja inferior contiene tanto pLDH como PfHRP2, lo que indica que P. falciparum es positivo.

Se estimó el límite de distinción de color en el que los colores rojo y azul eran distinguibles utilizando la misma definición de LoD. Se puede observar que la curva superior en la Fig. 5 siempre fue mayor que los valores más 3SD de la curva inferior después de 7,8 mg mL-1, establecido como límite de distinción de color (figura insertada en la Fig. 5).

Validación de AFL bicolor mediante pruebas de muestras clínicas

Para las 15 muestras negativas analizadas, las intensidades de color están por debajo del LD para pLDH y PfHRP2 y, por lo tanto, se consideran negativas para la malaria. Para distinguir los tipos de infección y estimar las concentraciones de antígenos para las 10 muestras positivas a la malaria, se realizó discriminación de color con los valores RGB del análisis de ImageJ. Dado que el pLDH es específico para todos y se une a todas las especies de malaria, se puede esperar la presencia de pLDH en todas las muestras positivas de malaria. La concentración de pLDH se puede estimar por sus áreas de decaimiento rojas correspondientes con la curva de calibración de la Fig. 4. Para todas las muestras positivas a malaria, se adoptó un método de ensayo y error de cuatro pasos para determinar si la muestra es P. falciparum o no (P. vivax, P. ovale, o P. malariae).

  • Paso 1: ImageJ se utiliza para calcular las áreas de decaimiento rojo y azul para la línea de prueba, luego se calculó la relación entre las áreas de decaimiento rojo y azul y se definió como ratio_cal.

  • Paso 2: Dado que el pLDH está presente en todas las muestras clínicas positivas, asuma que la muestra contiene solo pLDH y correlacione las áreas de desintegración roja medidas en el Paso 1 con las concentraciones de pLDH, con la curva de calibración de la Fig. 4a.

  • Paso 3: Encuentre el valor de la relación de áreas de decaimiento rojo a azul (eje y) en la curva azul superior de la Fig. 5 a la concentración de pLDH calculada (de la etapa 2), y defínala como ratio_ref.

  • Paso 4: consistirá en dos escenarios: (1) Si ratio_cal ≥ ratio_ref, entonces la muestra cae en la región por encima de la curva azul superior de la Fig. 5 (región de pLDH solamente), indicando no P. falciparum, pero malaria positiva (P. vivax, P. ovale, o P. malariae). En este escenario, las concentraciones estimadas de pLDH del paso 2 son válidas, ya que las muestras solo contienen pLDH; (2) Si ratio_cal < ratio_ref, entonces la muestra cae en la región entre la curva azul superior y la curva roja inferior de la Fig. 5 (región pLDH + PfHRP2), indicando P. falciparum positivo. En este escenario, las concentraciones estimadas de pLDH del paso 2 no son válidas ya que las muestras contienen pLDH y PfHRP2, y la curva de calibración de la Fig. 4a no se puede aplicar. La interpretación del color de mezcla era complicada, y posiblemente sesgada por el contraste de la imagen. Tampoco fue fácil crear curvas estándar que puedan cubrir todos los escenarios de combinaciones de colores.

Las áreas de decaimiento rojo y azul y las proporciones de color de las muestras positivas de P. falciparum y P. vivax se presentaron en las Tablas 1 y 2, respectivamente.

Tabla 1 Resultados del análisis de imágenes y estimación de concentraciones de antígenos y tipo de infección por malaria a partir de muestras clínicas positivas de Plasmodium falciparum
Tabla 2 Resultados del análisis de imágenes y estimación de concentraciones de antígenos y tipo de infección por malaria a partir de muestras clínicas de Plasmodium vivax

Como se muestra en la Tabla 1, las 5 muestras se confirmaron como positivas a P. falciparum mediante examen microscópico. Utilizando el método de ensayo y error de cuatro pasos ilustrado anteriormente, la relación de referencia rojo a azul (ratio_ref) se estimó en el área de desintegración roja correspondiente mediante las curvas de calibración pLDH y se comparó con la relación rojo a azul de las muestras clínicas (ratio_cal). Dado que ratio_cal < ratio_ref para todas las 5 muestras enumeradas en la Tabla 1, todas las muestras entran en el escenario dos en el paso 4, como se describió anteriormente. Entonces se podría concluir que la muestra es positiva para P. falciparum. Por ejemplo, la muestra No. 25 se confirma como P. falciparum positivo por microscopía. El área de desintegración roja y el área de desintegración azul en la línea de prueba son 917.11 y 499.20, respectivamente. Por lo tanto, la relación rojo-azul de la muestra No.25 (ratio_cal) es de 1,84. La relación de referencia rojo a azul en el área de desintegración roja correspondiente (917.11) (ratio_ref) se calcula mediante la curva de calibración pLDH de la Fig. 4a, y el valor es 1.95. Desde 1.95 (ratio_ref) > 1.84 (ratio_cal), la muestra No.25 se confirma como P. falciparum positivo por discriminación de color de LFA. Esto concuerda con los resultados de microscopía y ELISA.

Como se muestra en la Tabla 2, las 5 muestras se confirmaron como P. vivax positivo por examen microscópico. Del mismo modo, se obtuvieron ratio_ref y ratio_cal. Desde ratio_cal > ratio_ref para todas las 5 muestras enumeradas en la Tabla 2, todas las muestras caen en la región de pLDH solamente, lo que indica malaria positiva pero negativa para P. falciparum. En este caso, la curva de calibración pLDH de la Fig. se podría aplicar 4a para obtener las concentraciones de pLDH para todas las muestras de la Tabla 2. Por ejemplo, la muestra No. 471 se confirma como positiva a P. vivax por microscopía. El área de desintegración roja y el área de desintegración azul en la línea de prueba son 631.10 y 299.22, respectivamente. Por lo tanto, la relación rojo-azul de la muestra No.471 (ratio_cal) es de 2,11. La relación de referencia rojo a azul en el área de desintegración roja correspondiente (631.10) (ratio_ref) se calcula mediante la curva de calibración pLDH de la Fig. 4a, y el valor es 1.63. Desde 2.11 (ratio_cal) > 1.63 (ratio_ ref), la muestra No.471 se confirma como malaria positiva pero P. falciparum negativa por discriminación de color de LFA. Esto concuerda con los resultados de microscopía y ELISA.

Para todas las muestras de la Tabla 2, cabe señalar que los resultados de cuantificación de pLDH mostraron discordancia entre los métodos de AFL y ELISA. La concentración estimada en AFL fue inferior a la del ELISA. Este error podría atribuirse a la diferencia en las curvas estándar para la muestra clínica tampón y la muestra de sangre completa . También debe tenerse en cuenta que, para la muestra No.486, las concentraciones de PfHRP2 con los métodos LFA y ELISA son de 0 y 3,35 ng mL−1, respectivamente, ya que 3,35 ng mL−1 ya están más allá del LD de LFA para la detección de PfHRP2.

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