Respuestas de células T y anticuerpos inducidas por una dosis única de vacuna ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222) en un ensayo clínico de fase 1/2

Procedimientos del estudio y procesamiento de muestras

Detalles completos sobre la realización del ensayo controlado aleatorizado de fase 1/2 de ChAdOx1 nCoV-19 (AZD1222), incluido el protocolo del ensayo, se publicaron con anterioridad7. Este estudio se registró en el ISRCTN (15281137) y ClinicalTrials.gov (NCT04324606). En este documento solo se incluyen datos de voluntarios vacunados de dosis única. Antes de la inscripción, todos los participantes dieron su consentimiento informado por escrito. El ensayo se llevó a cabo de acuerdo con los principios de Buenas Prácticas Clínicas y se obtuvo la aprobación de un comité nacional de ética (South Central Berkshire Research Ethics Committee, referencia 20/SC/0145) y de una agencia reguladora del Reino Unido (la Agencia Reguladora de Medicamentos y Productos Sanitarios). Antes de que comenzara la contratación, se nombró una junta independiente de supervisión de la seguridad de los datos.

Se tomaron muestras de sangre el día de la vacunación y 7, 14, 28 y 56 días después de la vacunación. En los momentos de análisis inmunológicos, se tomaron muestras de sangre en tubos de recolección simples y heparinizados. Las muestras se procesaron dentro de las 4 h de la extracción de sangre. Se procesaron tubos planos para la recolección de suero sanguíneo. Los tubos se centrifugaron a 1.800 rpm durante 5 minutos, y el suero se recolectó para almacenarlo a -80 °C hasta que se necesitara. Se procesaron tubos heparinizados para la recolección de PBMCS y plasma sanguíneo por centrifugación de gradiente de densidad. La sangre se decantó en tubos de Leucosep (Greiner Bio-One) que contenían Linfoprep (STEMCELL Technologies) y se centrifugó a 1.000 g durante 13 minutos sin el freno. Se recolectó una fracción de plasma sanguíneo y se almacenó a -80 ° C, mientras que la muestra restante se decantó en un tubo Falcon fresco y se llenó con medios R0 (medios de cultivo celular RPMI-1640 que contenían 1% de penicilina–estreptomicina y 2 mm de L-glutamina (todos Sigma-Aldrich). Las muestras se centrifugaron de nuevo a 1.800 rpm durante 5 minutos; el sobrenadante se vertió y el gránulo de la célula se resuspendió una vez más en medios R0 para el lavado. Después de la centrifugación, el pellet celular se resuspendió en 10 ml de medio R10 (RPMI-1640 que contenía 1% de penicilina–estreptomicina, 2 mm de L-glutamina y 10% de suero fetal de ternera (FCS, Labtech) para el recuento.

Las células se contaron utilizando un contador de casitas (OMNI Life Science) para su uso en ensayos en fresco o para criopreservación. Los ensayos realizados en células frescas fueron ELISpot y CI solamente (descritos a continuación). Todas las células restantes se congelaron a una concentración de 8-12 × 106 PBMCs por ml. Después de la centrifugación (1800 r.p.m., 5 min) las células se resuspendieron en FCS frío a la mitad del volumen total de congelación. Las celdas se colocaron en un refrigerador (2-8 °C) durante 20 minutos antes de agregar un volumen igual de FCS frío que contenía 20% de dimetilsulfóxido. Se prepararon alícuotas de un mililitro y se transfirieron rápidamente a celdas de enfriamiento (Corning) para congelarse a -80 °C durante la noche. Los tubos se transfirieron a un congelador de temperatura ultrabaja de -150 ° C hasta que se requería.

Se obtuvieron muestras de plasma convaleciente de pacientes adultos hospitalizados (≥18 años) ingresados con infección por SARS-CoV-2 con reacción en cadena de la polimerasa positiva o de trabajadores sanitarios inscritos en estudios de vigilancia de la COVID-19. Los estudios fueron aprobados por los siguientes comités: Enfermedades Gastrointestinales en Oxford: subestudio de COVID (Comité de Ética de Investigación de Sheffield, referencia 16/YH/0247); Protocolo de Caracterización Clínica ISÁRICA/OMS para Infecciones Emergentes Graves (Comité de Ética de Investigación de Oxford C, referencia 13/SC/0149); y Proyecto de Inmunómica de Sepsis (Comité de Ética de Investigación de Oxford C, referencia 19/SC/0296). Tanto los participantes asintomáticos como los sintomáticos se evaluaron para cada ensayo. Anteriormente se describieron detalles adicionales sobre los procedimientos experimentales realizados en muestras de plasma convaleciente 7.

Se sintetizaron péptidos y estimulaciones

Péptidos que abarcan toda la longitud de la secuencia de proteína de espiga del SARS-CoV-2 para su uso en ensayos de células T específicas de antígenos (ProInmune). Un total de 253 péptidos fueron sintetizados como 15 mers superpuestos por diez aminoácidos. También se sintetizaron péptidos para la secuencia líder de tPA N-terminal, que se incluyó para aumentar la expresión del antígeno de la vacuna del vector adenoviral. Los detalles de las secuencias de péptidos y la agrupación para los ensayos se muestran en la Tabla suplementaria 3. En resumen, para el ensayo de citometría de flujo Cytek Aurora, el ensayo de perfilado de citocinas Th1/Th2 de Descubrimiento a Escala Meso (MSD) y los CI, se hicieron dos conjuntos de péptidos separados que abarcan las subunidades S1 (134 péptidos) y S2 (119 péptidos) de la proteína de espiga SARS-CoV-2. Para el ensayo ELISpot, se hicieron 12 grupos de 18-24 péptidos que consistían en seis grupos cada uno para las subunidades S1 y S2. En este ensayo se incluyó un grupo de secuencia líder de tPA separado (cinco péptidos).

Se realizó citometría de flujo en un analizador espectral Aurora Cytek

Se realizó citometría de flujo a partir de alícuotas congeladas de PBMCs de donantes de los días 0, 7, 14 y 28 después de la vacunación con ChAdOx1 nCoV19 (D0 n = 24, D7 n = 23, D14 n = 25 y D28 n = 24). Las células se descongelaron en medios que contenían > 5 U ml-1 de benzonasa y se resuspendieron en medios RPMI completos suplementados con FCS al 10%, L-glutamina y penicilina-estreptomicina a una concentración de 2 × 107 células por ml. Luego, se platearon 2 × 106 PBMCs por pocillo en una placa de 96 pocillos y se estimularon con péptidos sintéticos que abarcan la proteína de pico SARS-CoV-2 dividida en dos piscinas separadas para las subunidades S1 y S2 (Tabla Suplementaria 3) a una concentración final de 2 µg ml-1 o medios como control. Se estimuló un pocillo por donante con forbol 12-miristato 13-acetato y ionomicina (Cóctel de Activación Celular, BioLegend) como control positivo. PBMCs se co-estimular la presencia de anticuerpos anti-humanos CD28, CD49d (1 µg ml−1; Life Technologies) y CD107a-BV785 (BioLegend) durante 2 h a 37 °C con un 5% de CO2 y, a continuación, incubado durante 16 h adicionales tras la adición de 1 µg ml−1 de brefeldina A y monensina a cada pocillo (BioLegend).

Los PBMC se lavaron en tampón FACS (solución salina tamponada con fosfato con albúmina sérica bovina al 0,5% y EDTA al 1%) y se teñieron con un cóctel de anticuerpos de superficie, incluidos UV Antihumano Vivo/Zombi Muerto, CD4-AF700, CD19-Spark NIR 685, CD56-APC, CCR7-PerCP/Cy5.5, PD1-PE/Dazzle 594, CD57-PE/Cy7(BioLegend) CD8-AF405, CD45RA-Superbrillante 702, CD27-PerCP eF710 y CD20-AF532 (Thermo Fisher Scientific); CD16-BUV495, CD3-BUV661, CD138-BUV805, NKG2A-BV480 e IgM-BB515 (BD Biociencias); y NKG2C-PE y KLRG1-VioBlue (Miltenyi) en tampón FACS con Tampón de Tinción Brillante al 10% Plus (Biociencias BD). Los PBMC se incubaron a 4 ° C en la oscuridad durante 30 minutos y luego se lavaron dos veces en tampón FACS. Los PBMC se incubaron en solución de citofijo/CitoPerm (BD Biosciences) a 4 °C en la oscuridad durante 30 minutos y luego se lavaron dos veces en tampón Permanente/Lavado y luego se teñieron con un cóctel de anticuerpos intracelulares, incluidos los antihumanos IFN-γ-BV650 e IL-2-BV605 (BioLegend); IgG-BV421, TNF-α-BUV395, CD69-BV750, CD71-BUV563 y CD25-BV737 (BD Biosciences); y Ki-67-APC eF780 (Thermo Fisher Scientific) en Perm/Wash. Los PBMC se incubaron a 4 ° C en la oscuridad durante 30 minutos, se lavaron dos veces en tampón Permanente / Lavado, una vez en tampón FACS y luego se volvieron a suspender en 200 µl de tampón FACS para su adquisición en un analizador espectral Cytek Aurora de cuatro láser personalizado utilizando SpectroFlo v2.2 (Cytek Biosciences).

La compensación de fluorocromo único se calculó en perlas (BD Biosciences y Miltenyi) o PBMCS humanas. El análisis de los datos se realizó en FlowJo (v10.6. 2) mediante una estrategia de compuerta jerárquica (Fig. 6) y Prism 8 (GraphPad). Las respuestas específicas de péptidos se calcularon restando los controles no estimulados de las muestras estimuladas por péptidos.

Se realizó un muestreo descendente y un análisis de tSNE en linfocitos vivos cerrados en FlowJo v. 10. 7.1. Se recolectó una muestra aleatoria de 100.000 células por donante y punto de tiempo y se concatenó en un solo archivo. Se incluyeron como parámetros todos los colores fluorocromos y el punto de tiempo de la muestra. El análisis tSNE se implementó en FlowJo v. 10. 7.1 con 100.000 iteraciones y una perplejidad de 30 y utilizando el algoritmo de gradiente Barnes–Hut.

Perfil de citoquinas MSD Th1/Th2

Las respuestas de citoquinas Th1/Th2 se midieron en sobrenadantes de cultivo de tejidos a partir de la estimulación de PBMCs con péptidos sintéticos que cubrían la proteína de espiga. Luego, se resuspendieron 5 × 105 PBMC recién aislados en 250 µl de medios R10 en placas de fondo en U de 96 pocillos y se suplementaron con 1 µg ml-1 de CD28 y CD49d antihumanos. Se agregaron péptidos que abarcan las subunidades S1 y S2 de la proteína espiga del SARS-CoV−2 (Tabla Suplementaria 3) a pocillos separados a una concentración de 2 µg ml-1. Cada muestra también incluía un control no estimulado (solo para medios). Después de una incubación de 16-18 h a 37 °C con 5% de CO2, las células se peletizaron por centrifugación (1.800 rpm, 5 min) y se cosecharon 200 µl de sobrenadante. Los sobrenadantes de las estimulaciones S1 y S2 se combinaron y almacenaron a -80 °C hasta que fue necesario.

Las respuestas de citoquinas se analizaron utilizando el Kit de Citoquinas Proinflamatorias (humanas) MSD V-PLEX Panel 1, validado por MSD. Cada placa está recubierta con nueve anticuerpos monoclonales de captura diferentes contra nueve citocinas diferentes dispuestas en puntos independientes en la base de cada pocillo. Las citocinas IFN-y, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-8, IL-10, IL-12p70, IL-13 y TNF-α se asociaron con una respuesta de células T de tipo Th1 o Th2.

Los sobrenadantes se diluyeron 1:2 para las muestras no estimuladas y 1:10 para las muestras estimuladas S1/S2 en el diluyente MSD 2. El kit proporciona un calibrador liofilizado de múltiples analitos que, una vez reconstituido, se utilizará como curva estándar mediante una dilución en serie cuádruple para formar una curva estándar de ocho puntos chapada por duplicado. Las mediciones de citoquinas se realizaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las placas se leyeron en un lector MSD dentro de los 15 minutos posteriores a la adición del búfer de lectura.

Los datos se analizaron utilizando MSD Discovery Workbench 4.0. Las muestras se repitieron si alguna muestra tenía una réplica con un coeficiente de variación superior al 20%. Las réplicas se leyeron fuera de la curva estándar y se multiplicaron por el factor de dilución, y la concentración se notificó como el promedio de las réplicas en pg ml−1. La concentración de la muestra no estimulada se restó de la concentración de la muestra estimulada (sustracción de fondo). Los valores negativos de las sustracciones de fondo fueron reemplazados por ceros. Un valor arbitrario de 0.0001 se agregó a las sustracciones de fondo en todas las muestras para superar la presencia de valores nulos elevados de muestras demasiado bajas para ser leídos fuera de la curva estándar.

Se analizaron muestras de isotipo y subclase ELISA estandarizadas

de participantes vacunados con ChAdOx1 nCoV-19 y muestras de plasma convaleciente para IgG1, IgG3, IgA e IgM anti-espiga. Las muestras de los participantes vacunados con MenACWY se analizaron para detectar anticuerpos anti-espiga IgA e IgM solamente. Se utilizó ELISA estandarizado para cuantificar las respuestas IgG1, IgG3, IgA e IgM específicas de picos del SARS-CoV-2 circulantes. Anteriormente se publicaron todos los detalles metodológicos de este análisis 23. Brevemente, las placas ELISA se cubrieron durante la noche con 5 µg ml−1 de proteína de espiga de longitud completa del SARS-CoV-2. Después del bloqueo con Caseína Bloqueante en PBS (Thermo Fisher Scientific), las muestras (dilución mínima de 1:50) se incubaron durante 2 h a 37 °C con agitación de 300 rpm. La curva estándar y los controles internos se crearon a partir de suero de referencia utilizando un conjunto de suero de donantes de títulos altos. A continuación, se añadió un anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina (dependiente de la subclase de inmunoglobulina o del isotipo detectado) y se incubó durante 1 h a 37 °C con agitación de 300 rpm. Las placas se desarrollaron utilizando sustrato de fosfatasa alcalina PNPP (Thermo Fisher Scientifc) durante 1-4 h a 37 °C con 300 rpm de agitación y lectura a 405 nm cuando el control interno alcanzó un OD405 de 1. Los criterios de aprobación / fallo de la placa se describen en ref. 23.

Isotipo y subclase ELISA de densidad óptica

Se detectaron respuestas IgG2, IgG4 e IgE específicas para antígenos en ausencia de un control sérico específico para antígenos mediante ELISA de densidad óptica (DO). Anteriormente se describieron procedimientos detallados para este análisis 23. Brevemente, las placas ELISA se cubrieron durante la noche con 5 µg ml−1 de proteína espiga de longitud completa SARS-CoV-2, más un control de inmunoglobulina humana comercial para el isotipo o subclase de anticuerpos que se estaba analizando. Después del bloqueo con caseína bloqueante en PBS, muestras de prueba y controles negativos pre-pandémicos (mínimo 1:50 de dilución) se chaparon durante 2 h a 37 ° C con agitación de 300 rpm. Se añadieron diferentes anticuerpos secundarios conjugados con fosfatasa alcalina en función del isotipo o subclase de inmunoglobulina que se analizaba durante 1 h a 37 °C con agitación de 300 rpm. Las placas se desarrollaron utilizando sustrato de fosfatasa alcalina PNPP durante 1-4 h a 37 °C con agitación de 300 rpm y lectura a 405 nm cuando el control de inmunoglobulina alcanzó un OD405 especificado. Los cálculos de corte negativos se describen en ref. 23.

Avidez ELISA

Se evaluó la avidez de IgG específica para picos del SARS-CoV-2 de voluntarios que tuvieron una respuesta cuantificable en el día 28. Se evaluó la avidez de anticuerpos IgG totales específicos del sérico del donante contra el SARS-CoV-2 mediante ELISA de desplazamiento de tiocianato de sodio (NaSCN). Las placas ELISA Nunc MaxiSorp (Thermo Fisher Scientific) se recubrieron durante la noche (≥16 h) a 4 °C con 50 µl por pocillo de 2 µg ml−1 de proteína de espiga trimérica del SARS-CoV-2 diluida en PBS. Las placas se lavaron tres veces con PBS/Tween (0.05%) (PBS/T) y roscado seco. Las placas se bloquearon durante 1 h con 100 µl por pocillo de Caseína Bloqueadora en PBS (Thermo Fisher Scientific) a 20 °C. Se diluyeron muestras de prueba y un suero de control positivo en tampón de bloqueo para normalizarlas a un OD405 de 1, y se agregaron 50 µl por pocillo por duplicado a cada fila de la placa (excepto la última fila, donde solo se agregó tampón de bloqueo). Las placas se incubaron durante 2 h a 20 ° C y luego se lavaron tres veces con PBS / T y se secaron con un golpecito. Se añadieron concentraciones crecientes de NaSCN (Sigma-Aldrich) diluidas en PBS a 50 µl por pocillo en cada fila de la placa (1 M, 2 M, 3 M, 4 M, 5 M y 6 M), excepto en la primera y la última fila, en las que solo se añadió PBS. Las placas se incubaron durante 15 minutos a 20 ° C y luego se lavaron seis veces con PBS / T y se secaron con un golpecito. El anticuerpo fosfatasa alcalina anti-IgG humana (específica de la cadena γ) producido en cabra (Sigma-Aldrich) se diluyó 1:1.000 en tampón de bloqueo y se añadieron 50 µl por pocillo a la placa. Las placas se incubaron durante 1 h a 20 ° C y luego se lavaron tres veces con PBS / T y se secaron con un golpecito. Luego, se agregaron 100 µl por pocillo de sustrato de fosfatasa alcalina PNPP (Thermo Fisher Scientific) y se incubaron placas a 20 °C. Se midió la DO a 405 nm (OD405) utilizando un lector de absorbancia ELx808 (BioTek) hasta que los pocillos de muestra no tratados alcanzaron una OD405 de 1 (0,8–2,0). Se utilizó el software Gen5 ELISA v3.09 (BioTek) para trazar la muestra de prueba OD405 contra la concentración de NaSCN, y se ajustó a los datos una función de estriado con factor de suavizado 0.001. Para cada muestra, se interpoló la concentración de NaSCN necesaria para reducir el OD405 al 50% de la sin NaSCN (IC50) a partir de esta función y se notificó como una medida de avidez.

Se realizaron ensayos ELISpot ex vivo de IFN-γ

Se realizaron ensayos ELISpot en PBMCs recién aisladas antes y 14 días después de la vacunación con ChAdOx1 nCoV19, como se describió previamente7. Los ensayos se realizaron utilizando placas multipantalla IP ELISpot (Milipora) y se recubrieron durante la noche a 4 °C con 10 µg ml−1 de anticuerpo de recubrimiento humano anti-IFN-γ (clon 1-D1K, Mabtech) en tampón de carbonatos, antes de lavarse tres veces con PBS y bloquearse con medios R10 durante 2-8 h. Luego, se agregaron 2,5 × 105 PBMCs a cada pocillo de la placa, junto con 13 pocillos de péptidos que cubrían la proteína de punta SARS-CoV-2 y el tPA N-terminal secuencia líder a una concentración final de 10 µg ml−1 (Tabla suplementaria 3). Cada ensayo se realizó por triplicado y se incubó durante 16-18 h a 37 ° C con un 5% de CO2.

Las placas se desarrollaron lavando seis veces con PBS / T, seguido de la adición de 1 µg ml−1 de anticuerpo detector anti-IFN-γ (7-B6-1-Biotina) a cada pocillo. Después de una incubación de 2-4 horas, las placas se lavaron de nuevo, y se agregó SA-ALP 1:1,000 durante 1-2 h. Después de un paso de lavado final, las placas se desarrollaron utilizando sustrato cromogénico BCIP NBT-plus (Musgo).

Las placas de ELISpot se contaron utilizando un contador de ELISpot automatizado de AID (AID Diagnostika, algoritmo C), utilizando configuraciones idénticas para todas las placas, y los recuentos de puntos se ajustaron solo para eliminar artefactos. Las respuestas se promediaron en los pozos triplicados y se restó la respuesta media de los pozos no estimulados (control negativo). Los resultados se expresan como SFCs / 106 PBMCs. Las respuestas a un péptido se consideraron positivas si las respuestas restadas de fondo fueron > 40 SFU / 106 PBMCs. Si las respuestas fueron >80 SFCs/106 PBMCs en los pocillos de control negativo (PBMCs sin antígeno) o <800 SFCs/106 PBMCs en los pocillos de control positivo (enterotoxina B estafilocócica agrupada a 0,02 µg ml−1 y fitohemaglutinina-L a 10 µg ml−1), los resultados se excluyeron del análisis posterior.

ICS

ICS se realizó en PBMC recién aislados estimulados con péptidos agrupados S1 y S2. Luego, se resuspendieron 3 × 106 PBMC en 5 ml de tubos FACS de polipropileno a un volumen de 1 ml en medios R10 suplementados con 1 µg ml−1 de CD28 y CD49d antihumanos y 1 µl de CD107A PE-Cy5 (eBiociencia). Se agregaron depósitos de péptidos S1 y S2 (Tabla suplementaria 3) a una concentración de 2 µg ml−1. Cada muestra también incluyó un control positivo (enterotoxina B de S. a 1 µg ml−1; Sigma Aldrich) y un control no estimulado (solo medio). Las células se incubaron a 37 ° C con un 5% de CO2 durante 16-20 h, con brefeldina A (3 µg ml−1) y monensina (2 mM) (eBiociencia) añadidas después de 2 h

Al final de la incubación, las células se lavaron en tampón FACS (PBS que contiene 0,1% de albúmina sérica bovina y 0,01% de NaN3) y se transfirieron a una placa de cultivo de tejidos con fondo en U de 96 pocillos para su tinción. Primero se añadió un cóctel de tinción de superficie que contenía 2,5 µl de una dilución 1: 40 de tinción Viva/Muerta Aqua (Thermo Fisher Scientific) y 1 µl de BV711 CCR7 (BioLegend) en 46,5 µl de tampón FACS. Las células se incubaron en la oscuridad durante 20 minutos y se lavaron con tampón FACS. Luego, se agregaron 100 µl de solución de CitoFix/CytoPerm (BD Biosciences) a cada pocillo y se dejaron incubar durante 20 minutos adicionales. Las células se lavaron con tampón Permanente/lavado antes del ICS. El cóctel de circuitos integrados contenía 0,025 µl de CD45RA BV605, 0,025 µl de TNF-α PE-Cy7, 0,1 µl de IFN-γ FITC, 0,025 µl de CD14 e450, 0,025 µl de CD19 e450, 0,5 µl de CD3 AF700, 1 µl de IL-2 BV650, 1,25 µl de IL-5 PE, 2,5 µl de IL-13 APC, 3,5 µl de CD4 PerCP Cy5.5 y 5 µl de CD8 APC-eF780, hasta un volumen total de 50 µl diluido en tampón FACS. Las muestras se mancharon en la oscuridad durante 30 minutos. Las células se lavaron dos veces con tampón Permanente/Lavado y dos veces con tampón FACS antes de resuspenderse en 100 µl de paraformaldehído al 1%.

Los controles de compensación se prepararon frescos para cada lote utilizando Onecomp eBeads (eBioscience). Las células se mantuvieron en hielo y se filtraron a través de un filtro de 35 µm antes de su adquisición. Las células se adquirieron en un citómetro de flujo BD LSRFortessa de cinco láser (BD Biosciences) utilizando FACSDiva v8.02 (BD Biosciences) y los datos se analizaron en FlowJo v10.7. Para el análisis de la muestra se aplicó una estrategia de apertura jerárquica (Fig. 7). Se aplicó un proceso de control de calidad para eliminar muestras con menos de 100.000 eventos en la puerta CD3+ viva y muestras con <Respuesta de citoquinas al 1% a S. enterotoxina B (CD4+ y CD8+ IFN-γ+, CD8+ TNF-α+). Se aplicó un límite inferior de detección, y solo se incluyeron en el análisis muestras con una respuesta ELISpot superior a 200 SFCs/106 PBMCs.

Análisis estadístico

Todas las pruebas estadísticas, así como toda la representación gráfica de los datos, se realizaron en GraphPad Prism 8.4.3. Los datos se presentan como medianas con RIC. Para verificar la normalidad de los datos, se utilizaron las pruebas d’Agostino–Pearson. Las muestras no emparejadas se compararon mediante pruebas U de Mann-Whitney, y las muestras emparejadas se compararon con la prueba de Wilcoxon. Todas las pruebas fueron de dos colas, con una tasa de error del 5% por comparación. La corrección de Bonferroni se utilizó para corregir comparaciones múltiples. Las correlaciones se analizaron utilizando la prueba de rango de Spearman. Los valores de P menores de 0,05 fueron considerados significativos.

Resumen de informes

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de Informes de Investigación de la Naturaleza vinculado a este artículo.

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