Oxidación rápida de Cisteína a Cistina en Soluciones Acuosas – Implicaciones para el Análisis de Medios Gastados

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Oxidación de cisteína en medios de cultivo celular

Los medios de cultivo celular normalmente proporcionan todos los aminoácidos necesarios para que las células crezcan. Las limitaciones en uno o más aminoácidos no solo resultan en un crecimiento subóptimo de los cultivos celulares, sino que también afectan negativamente el rendimiento y la calidad del producto. Durante el desarrollo del proceso, el análisis de medios usados ayuda a monitorear las concentraciones de aminoácidos y determinar las tasas de consumo para detectar y evitar tales limitaciones.

Esto es particularmente difícil en el caso de la cisteína, ya que se oxida fácilmente para formar cistina, un dímero de dos moléculas de cisteína, conectadas a través de un puente de disulfuro. Recientemente, un artículo dedicado a la temperatura y la estabilidad de almacenamiento de los medios de cultivo celular también informó que el aminoácido cisteína era particularmente inestable en las condiciones probadas (Krattenmacher et al., 2018). Esto está de acuerdo con nuestra experiencia, ya que a menudo medimos nada o solo rastros de cisteína, mientras que la cistina, su forma oxidada, se detecta claramente. Llevamos a cabo experimentos que investigan el comportamiento redox de la cisteína y la cistina en el agua, teniendo en cuenta que las condiciones más complejas que se encuentran en los medios de cultivo celular (gastados), podrían facilitar una química más compleja.

Interconversión de cisteína a cistina en agua

Para obtener más información sobre la (in)estabilidad de la cisteína, preparamos una solución de 1 mM en agua, la almacenamos a temperatura ambiente y tomamos muestras en diferentes momentos. Tomamos varias muestras en el transcurso de 26 h y luego una muestra «a largo plazo» después de 6 días. Cada muestra se derivó directamente después del muestreo y se midió utilizando nuestro gradiente de análisis de aminoácidos patentado en un sistema Agilent 1290 UHPLC-DAD. Una solución de cistina de 0,5 mM se trató de la misma manera y sirvió como control.

Como se ve en la Tabla 1 y en la Figura 1, incluso una muestra de una solución de cisteína recién preparada (0 h) contenía cantidades detectables de cistina. Ya el 11% del aminoácido estaba inicialmente presente en forma de dímero. Este valor fue bastante estable durante las primeras horas, posiblemente porque la cisteína ya contenía algo de cistina antes de la solubilización. Después de 24 h, más cisteína se había desplazado hacia la cistina, dando como resultado un 65% de cisteína y un 35% de cistina. Después de 6 días, el 98% de la cisteína se había transformado en cistina (Figura 2).

En contraste con la cisteína, la cistina demostró ser estable en solución. Su concentración se mantuvo constante y no se pudo detectar cisteína en ninguna de las muestras de control (ver Tabla 2, Figura 1+2).

Además de las mediciones descritas anteriormente, las alícuotas de las soluciones de cisteína y cistina se trataron con TDT (ditiotreitol) o TCEP (tris(2-carboxietil)fosfina), dos agentes reductores comunes. Como se muestra en las Tablas 3 a 6, ambos reactivos protegieron la cisteína de la oxidación a cistina, e incluso redujeron la cistina a cisteína libre casi por completo. Los efectos reductores de la TCEP fueron más fuertes en comparación con la TDT.

Conclusión

La cisteína es un componente común de los medios de cultivo celular, pero a menudo no se detecta en muestras de medios gastados, debido a su inestabilidad en soluciones acuosas. El experimento descrito en esta nota muestra que la cisteína se oxida principalmente para formar cistina. La oxidación de cisteína a cistina también implica que la cisteína y la cistina no deben incluirse en la misma mezcla estándar. En su lugar, los estándares individuales de cisteína podrían prepararse y protegerse de la oxidación utilizando TCEP.

Además, observamos la oxidación de la cisteína para proceder aún más rápido en medios de cultivo celular enriquecidos con cisteína adicional (datos no mostrados). Esto debe tenerse en cuenta cuando se analizan las posibles limitaciones de aminoácidos mediante análisis de medios gastados. Por lo tanto, es importante contar con métodos de cuantificación adecuados.

Incluyendo cisteína y cistina, nuestro método de análisis de aminoácidos proporciona resultados cuantitativos para todos los aminoácidos proteinogénicos, así como para etanolamina, citrulina, hidroxiprolina, ornitina y taurina. Póngase en contacto con nosotros para solicitar más información y probarlo.

Análisis de aminoácidos rápido y fiable

Tablas y figuras

Pestaña. 1 Pestaña

. 1: Cantidades relativas (rel. Amt.) de cisteína y cistina en cisteína de 1 mm recién preparada en agua, medida por UHPLC-DAD después de la derivatización. El tiempo de muestreo se muestra en horas / días después de la preparación.

Tab. 2 Pestaña

. 2: Cantidades relativas (rel. Amt.) de cisteína y cistina en cistina de 0,5 mm recién preparada en agua, medida por UHPLC-DAD después de la derivatización. El tiempo de muestreo se muestra en horas / días después de la preparación.

Tab. Pestaña 3

. 3: Cantidades relativas (rel. Amt.) de cisteína y cistina en cisteína de 1 mm recién preparada más TDT de 0,5 mM en agua, medida por UHPLC-DAD después de la derivatización. El tiempo de muestreo se muestra en horas / días después de la preparación.

Tab. Pestaña 4

.4: Cantidades relativas (rel. Amt.) de cisteína y cistina en cisteína de 1 mm recién preparada más TCEP de 0,5 mM en agua, medida por UHPLC-DAD después de la derivatización. El tiempo de muestreo se muestra en horas / días después de la preparación.

Tab. Pestaña 5

.5: Cantidades relativas (rel. Amt.) de cisteína y cistina en cistina de 0,5 mm recién preparada más TDT de 0,5 mM en agua, medida por UHPLC-DAD después de la derivatización. El tiempo de muestreo se muestra en horas / días después de la preparación.

Tab. Pestaña 6

.6: Cantidades relativas (rel. Amt.) de cisteína y cistina en cistina de 0,5 mm recién preparada más TCEP de 0,5 mM en agua, medida por UHPLC-DAD después de la derivatización. El tiempo de muestreo se muestra en horas / días después de la preparación.

Fig. 1

Fig. 1: Mediciones de cisteína/cistina 0h después de la preparación de las soluciones. El primer panel muestra mediciones sin agente reductor, el segundo panel reducción de TDT y el tercer panel reducción de TCEP. Se muestran cromatogramas UHPLC-DAD centrados en los picos de cisteína y cistina medidos después de la derivatización.

Fig. 2

Fig. 2: Mediciones de cisteína/cistina 6d después de la preparación de las soluciones. El primer panel muestra mediciones sin agente reductor, el segundo panel reducción de TDT y el tercer panel reducción de TCEP. Se muestran cromatogramas UHPLC-DAD centrados en los picos de cisteína y cistina medidos después de la derivatización.

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