dvě barvy multiplexní lateral flow immunoassay systém rozdílně detekovat lidské malárie druhů na jeden test-line

Princip dvou-barevné LFA v multiplexní detekci malarických antigeny na jeden test linie LFA pás

V LFA, když vzorek je dávkován tekutý na vzorku pad a vlévá se do konjugát pad, modré a červené latexové částice zachytit pLDH a PfHRP2 antigeny, respektive. Antigeny vázané na latexové částice jsou následně přepravovány přes pás, a jsou zjištěny na zkušební linku, kde se směs detekce protilátek (pan)pLDH a PfHRP2 jsou funkcionalizované (Obr. 1). Změna barevných profilů vyvinutých ve zkušební oblasti odpovídá počtu zachycených modrých a červených latexových částic.

účinnost dvoubarevné LFA byla nejprve prokázána detekcí rekombinantních malarických antigenů s hroty v promývacím pufru v různých koncentracích. Byly testovány tři různé diagnostické scénáře: pouze pLDH, pouze PfHRP2 a souběžná infekce pLDH-PfHRP2. Pro co-detekce, pLDH a PfHRP2 byly smíchány v molárním poměru 1: 6, napodobovat klinické vzorky infekce P. falciparum . Patnáct minut po vzorku výjimku následoval wash buffer, barevné profily na test regionů byly zaznamenány. Pokud vzorek obsahoval pouze pLDH, byly pozorovány modré zkušební čáry (obr. 2a). Při současné detekci vykazovala zkušební oblast směs modré a červené barvy (obr. 2b). Pouze u vzorků PfHRP2 se zkušební čáry zčervenaly (obr. 2c). Kontrolní čáry na všech proužcích LFA vykazovaly barvu směsi modré a červené, což naznačuje, že červené i modré latexové částice byly transportovány přes proužky.

br. 2

obrázek 2

Reprezentativní testovací proužky dvou barev LFA. Na zkušebních liniích byly pozorovány odlišné barvy odpovídající typu antigenů, jako jsou modré testovací čáry pouze pro detekci pLDH, barva směsi B zkušebních linek pro současnou detekci a C červené testovací čáry pouze pro detekci PfHRP2. Směs barvy na ovládání linky je uvedeno červené a modré latexové částice migrovat po délce pásu

Vlastnosti v barevné profily LFA proužky

K provedení kvantitativní a kvalitativní metody v testu, intenzita profily LFA proužky byly analyzovány. Obrazy pásů byly získány pomocí 8megapixelové zadní kamery iPad Air 2 za stejných bílých LED světelných podmínek. Vzdálenost mezi testovací linkou a kontrolní linkou byla asi 200 pixelů a šířka čáry byla na obrázcích asi 50 pixelů. Pro získání barevných profilů RGB byly obrázky otevřeny pomocí softwaru ImageJ a provedeny příkazem „Color Profiler“. Pro zjednodušení byly analyzovány pouze profily červené a modré intenzity, protože profily zelené intenzity významně neovlivňovaly rozlišování červené a modré barvy a poskytovaly pomocnou hodnotu v barevných obrazech. Nitrocelulózová membrána testovacího proužku byla bílá, což mělo za následek vysoké intenzity pozadí. Barvy s kontrastem na zkušebních a kontrolních čarách generovaly vrcholy rozpadající se z intenzit pozadí (obr. 3).

br. 3

figure3

červené a modré profily intenzity testovacích proužků. RGB barevné profily byly získány z páskových obrazů z obr. 2. Pro jednoduchost byly zastoupeny červené a modré intenzity, s výjimkou zelené intenzity. a když se na testovacích linkách objevily modré barvy, červená intenzita byla více rozpadlá než modrá intenzita. Tento trend byl proto, že pozadí bílého proužku si zachovalo vysoké hodnoty RGB. b když se na zkušebních liniích objevila barva směsi, byly vytvořeny červené a modré píky odpovídající koncentraci antigenů. c Pro PfHRP2 detekce pouze, modré vrcholy bylo více chátral, než červené vrcholy, v opačném směru z pozorování,

Dvě zajímavé funkce v barevné profily byly pozorovány. Za prvé, když se na proužcích objevily modré zkušební čáry, červené vrcholy intenzity byly více rozpadlé než modré vrcholy v barevných profilech. Je to proto, že modrá barva si zachovala relativně vyšší hodnoty modrých pixelů než hodnoty červené. Obrázek 3 ukazuje červené a modré profily intenzity pásů extrahovaných z obrázků na obr. 2. Pro detekci pLDH pouze tam, kde byly pozorovány silné modré zkušební čáry, byly červené intenzity významně rozloženy od intenzit horního pozadí, více než modré vrcholy (obr. 3a). Ve stejném kontextu detekce PfHRP2 se zjevnými červenými zkušebními čarami v obrazech generovala nižší modré píky než červené píky (obr. 3c).

dalším znakem barevných profilů byly nespecifické barevné vrcholy na obr. 3a (modrá intenzita) a obr. 3C (intenzita červené), které nebyly spojeny s vývojem barvy latexovými částicemi. Nespecifická vazba nebo zkřížená reaktivita na zkušebních liniích nebyla pozorována pouhým okem. Vskutku, Obr. 2 ukázal jasné rozlišení barev pro každý detekční režim. Nespecifické vrcholy intenzity však byly vyvinuty kontrastem obrazu. Jak se na zkušebních linkách nahromadily latexové částice, tma se zvýšila, což mělo za následek snížení hodnot RGB. Všechny intenzity tedy vrcholí na obr. 3 nebyly z čistých barev, ale byly ovlivněny kontrastem obrazu. Nebylo snadné oddělit kontrast a čistou barvu od obrázků. Nicméně, jednoduchá korelační funkce byla stanovena výpočtem poměru červených a modrých rozpadových oblastí k rozlišení typu barvy. To bylo řešeno a je diskutováno v další části.

mez detekce a mez barevného rozlišení

pro další analýzu proužků, vyloučení subjektivity a potvrzení vizuálního limitu detekce byly vypočteny oblasti rozpadu červených a modrých vrcholů z obr. 3. Pro výpočet oblastí špiček bylo nejprve provedeno zarovnání píku na intenzitě pozadí. A pak Simpsonovo pravidlo 3/8 bylo použito na zarovnané vrcholy pro numerickou integraci pro výpočet oblastí.

výsledné grafy na obr. 4 ukázaly oblasti červených a modrých píků na testovacích liniích jako funkci koncentrací antigenu ze tří nezávislých experimentů. Červené i modré oblasti rozpadu se zvyšovaly se zvyšujícími se koncentracemi antigenu. Stupně oblastí rozpadu však závisí na typu barev vyvinutých na zkušebních linkách. Pouze u vzorků pLDH byly červené oblasti rozpadu vyšší než modré (obr. 4a), zatímco pouze vzorky PfHRP2 vykazovaly opačný trend (obr. 4c). K ověření účinnosti stanovení, mez detekce (LoD) byla odhadnuta přijetím standardní přístup definován jako průměr plus trojnásobek směrodatné odchylky (Snon-cíl + 3SD) slepého vzorku signálu. LoD, na které všechny červené a modré signály byly odlišitelné od slepého vzorku signálů byla odhadnuta na 31.2 ng mL−1 ve všech detekci scénáře (vložena čísla na Obr. 4).

br. 4

figure4

výpočet červených a modrých rozpadových oblastí na zkušebních linkách. Červené a modré rozpadové oblasti byly vypočteny z obr. 3 pouze pro detekci pLDH, B simultánní detekci pLDH a PfHRP2 a C pouze detekci PfHRP2. Různé stupně oblastí rozpadu mezi červenou a modrou intenzitou byly pozorovány jako funkce typů vzorků a koncentrací. Vložené grafy byly zvětšeny v nižších koncentracích. Lod pro odlišení od necílových vzorků byl 31,2 ng mL-1 pro všechny detekční režimy. Chybové úsečky označují směrodatné odchylky od trojím vyhotovení experimenty,

Next, poměr úpadek oblastí, z červené na modrou byla vypočtena tak, aby poskytují jednoduchý způsob rozlišování barev (Obr. 5). Podle očekávání se poměry rozpadu zvyšovaly se zvyšujícími se koncentracemi pLDH, které přisuzovaly intenzity červené barvy (horní křivka na obr. 5). Oblast nad horní modrou křivkou je oblast pouze pLDH, označující P.falciparum negativní.

br. 5

figure5

poměry červených a modrých rozpadových oblastí. Jednoduchá funkce barevných poměrů vypočtená z obr. 4 poskytlo kritérium pro rozlišení barev v závislosti na koncentracích vzorků. Modrá křivka s tvůrci kruhů byla nad ostatními křivkami, což naznačuje silné modré barvy. Pro modrou křivku byly koncentrace pLDH zobrazeny v ose x. Střední křivka s diamantovými značkami byla mezilehlou křivkou mezi křivkami horní a dolní, a představoval směsné barvy červené a modré. Pro střední křivku byly koncentrace PfHRP2 uvedeny v ose x a pLDH/PfHRP2 byl smíchán v poměru 1: 6. Spodní křivka ukazovala silné červené barvy. Pro červenou křivku byly koncentrace PfHRP2 uvedeny v ose x. Šipky ve vloženém grafu ukazovaly hranici barevného rozlišení, od které byly modré barvy odlišitelné od červených barev. Chybové úsečky jsou směrodatné odchylky z trojím vyhotovení experimenty,

naopak, poměr hodnoty snížily s rostoucí PfHRP2 koncentrace (spodní křivka na Obr. 5). Oblast pod spodní červenou křivkou obsahuje pouze PfHRP2. Vzhledem k tomu, že pLDH je pan-specifická, měla by být vždy přítomna u pozitivních případů malárie. U všech čtyř druhů lidské malárie nebude výsledek spadat do oblasti pouze PfHRP2.

poměry rozpadu při současné detekci byly střední a zahrnuty mezi horní křivku a dolní křivku na obr. 5, což znamená, že by měla být barva směsi modré a červené. Oblast mezi horní modrou křivkou a dolní červenou křivkou obsahuje jak pLDH, tak PfHRP2, což naznačuje P.falciparum pozitivní.

byla odhadnuta hranice barevného rozlišení, kdy byla červená a modrá barva rozlišitelná pomocí stejné definice LoD. Je možné pozorovat, že horní křivka na obr. 5 byla vždy vyšší než hodnoty plus 3SD spodní křivky po 7,8 mg mL-1, nastavené jako hranice barevného rozlišení (vložený obrázek na obr. 5).

Ověřování dva-barva LFA testováním klinických vzorků

15 negativní vzorky testovány, barvy, intenzity jsou nižší než mez Stanovitelnosti pro oba pLDH a PfHRP2, a proto jsou považovány za malárii negativní. Pro rozlišení typů infekcí a odhad koncentrace antigenu pro 10 vzorků pozitivních na malárii byla provedena barevná diskriminace s hodnotami RGB z analýzy ImageJ. Vzhledem k tomu, že pLDH je pan-specifický a váže se na všechny druhy malárie, lze přítomnost pLDH očekávat u všech pozitivních vzorků malárie. Koncentraci pLDH lze odhadnout podle odpovídajících červených rozpadových oblastí s kalibrační křivkou na obr. 4. Pro všechny pozitivní vzorky malárie byla přijata čtyřstupňová metoda pokusů a omylů, aby se zjistilo, zda je vzorek P. falciparum nebo non-P. falciparum (tj. vivax, P. ovale nebo P. malariae).

  • Krok 1: ImageJ se používá pro výpočet červených a modrých rozpadových oblastí pro testovací linii, pak byl poměr červených a modrých rozpadových oblastí vypočítán a definován jako ratio_cal.

  • Krok 2: Vzhledem k tomu, pLDH je přítomen ve všech pozitivních klinických vzorků, předpokládat, že vzorek obsahuje pLDH pouze a korelovat red kaz oblasti, měřeno v Kroku 1 s pLDH koncentraci, kalibrační křivka v Obr. 4a.

  • Krok 3: najděte hodnotu poměru červených a modrých rozpadových oblastí (osa y) na horní modré křivce na obr. 5 při vypočtené koncentraci pLDH (z kroku 2) a definujte ji jako ratio_ref.

  • Krok 4: bude skládat ze dvou scénářů: (1) Pokud ratio_cal ≥ ratio_ref, pak vzorek spadá do oblasti nad horní modrá křivka v Obr. 5 (pouze oblast pLDH), označující non-P.falciparum, ale pozitivní na malárii (P. vivax, P. ovale nebo P. malariae). V tomto scénáři, odhadované koncentrace pLDH z kroku 2 jsou platné, protože vzorky obsahují pouze pLDH; (2) Pokud ratio_cal < ratio_ref, pak vzorek spadá do oblasti mezi horní modrá křivka a spodní červená křivka v Obr. 5 (oblast pLDH + PfHRP2), označující P.falciparum pozitivní. V tomto scénáři, odhadované koncentrace pLDH z kroku 2 nejsou platné, protože vzorky obsahují pLDH a PfHRP2, a kalibrační křivka na obr. 4a nelze použít. Interpretace barvy směsi byla komplikovaná a možná zkreslená kontrastem obrazu. Také nebylo snadné vytvořit standardní křivky, které mohou pokrýt každý scénář barevných kombinací.

červené a modré rozpadové oblasti a barevné poměry vzorků pozitivních na P. falciparum a P. vivax byly uvedeny v tabulkách 1, 2.

Tabulka 1 Výsledky analýzy obrazu, a odhad koncentrace antigenu a typ malárie infekce Plasmodium falciparum pozitivních klinických vzorků
Tabulka 2 Výsledky analýzy obrazu, a odhad koncentrace antigenu a typ malárie infekce Plasmodium vivax klinických vzorků

Jak je uvedeno v Tabulce 1, 5 vzorků bylo potvrzeno jako P. falciparum pozitivní mikroskopií vyšetření. Pomocí čtyř-krokem metoda pokusů a omylů je uvedeno výše, červené na modrou referenční poměr (ratio_ref) byla odhadnuta na odpovídající červené rozkladu oblasti pLDH kalibrační křivky a porovnání s červené na modrou poměr klinických vzorků (ratio_cal). Od ratio_cal < ratio_ref pro všech 5 vzorků uvedených v Tabulce 1, všechny vzorky spadají do scénáře dvě v Kroku 4, jak je popsáno výše. Pak by bylo možné dospět k závěru, že vzorek je pozitivní na P.falciparum. Například vzorek č. 25 je mikroskopicky potvrzen jako P.falciparum pozitivní. Červená oblast rozpadu a modrá oblast rozpadu na zkušební lince jsou 917.11 a 499.20. Poměr červené k modré vzorku č. 25 (ratio_cal) je tedy 1,84. Referenční poměr červené k modré v odpovídající červené oblasti rozpadu (917.11) (ratio_ref)se vypočítá kalibrační křivkou pLDH na obr. 4a a hodnota je 1,95. Od 1.95 (ratio_ref) > 1.84 (ratio_cal), pak vzorek Č. 25 je potvrzen jako P. falciparum pozitivní LFA rozlišování barev. To souhlasí jak s mikroskopií, tak s výsledky ELISA.

jak je uvedeno v tabulce 2, 5 vzorků bylo potvrzeno jako P. vivax pozitivní mikroskopickým vyšetřením. Podobně byly získány ratio_ref a ratio_cal. Od ratio_cal > ratio_ref pro všech 5 vzorků uvedených v Tabulce 2, všechny vzorky spadají do pLDH pouze oblasti, což naznačuje, malárii pozitivní, ale negativní pro P. falciparum. V tomto případě kalibrační křivka pLDH na obr. 4a by mohla být použita k získání koncentrací pLDH pro všechny vzorky v tabulce 2. Například vzorek č. 471 je mikroskopicky potvrzen jako P.vivax pozitivní. Červená oblast rozpadu a modrá oblast rozpadu na zkušební lince jsou 631.10 a 299.22. Poměr červené k modré vzorku č. 471 (ratio_cal) je tedy 2.11. Referenční poměr červené k modré v odpovídající červené oblasti rozpadu (631.10) (ratio_ref)se vypočítá kalibrační křivkou pLDH na obr. 4a a hodnota je 1,63. Od 2.11 (ratio_cal) > 1.63 (ratio_ ref) je vzorek č. 471 potvrzen jako pozitivní na malárii, ale P. falciparum negativní diskriminací barev LFA. To souhlasí jak s mikroskopií, tak s výsledky ELISA.

u všech vzorků v tabulce 2 je třeba poznamenat, že výsledky kvantifikace pLDH ukázaly nesoulad mezi metodami LFA a ELISA. Odhadovaná koncentrace v LFA byla nižší než koncentrace ELISA. Tuto chybu lze přičíst rozdílu ve standardních křivkách pro klinický vzorek pufru a plné krve . Je třeba také poznamenat, že u vzorku č. 486 jsou koncentrace PfHRP2 s metodami LFA a ELISA 0 a 3,35 ng mL−1, protože 3,35 ng mL-1 je již za Lod LFA pro detekci PfHRP2.

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.