primær Menu

polymerasekædereaktionen (PCR) har været et enormt vigtigt laboratorieværktøj i årtier. Der er sket subtile ændringer i resultaterne og drastiske ændringer i detekteringen af et resultat i dette tidsrum, men værktøjet og dets pålidelighed har været bemærkelsesværdigt konsistente.

importeret POST*

Der er altid kommentarer som den nedenfor, der specifikt muses om fundet af MERS-CoV genetisk materiale hos asymptomatiske eller mildt syge mennesker. De spekulerer dybest set på pålideligheden af PCR.

hvad angår min viden er “infektion” defineret som beviset for et infektiøst middel og beviset for multiplikation af dette middel inde i kroppen (eller associeret inflammatorisk respons, der kan knyttes til dette middel). Derfor er mit spørgsmål: Hvor blev prøven taget fra de “asymptomatiske” sygeplejersker? PCR, som vi alle ved, registrerer bare nukleinsyrer. Så hvis multiplikation ikke kan bevises, og der ikke gives nogen lokal eller systemisk inflammatorisk respons, hvordan blev “forurening” (uanset om det skyldes inaktiverede dele af MERS-CoV eller endda komplette viruspartikler) udelukket? Dette er ikke kun et semantisk spørgsmål, men bør påvirke det rapporterede antal “sager”.

Prof Martin Haditsch skriver i ProMED

følelsen jeg får af disse er, at nogle ikke stoler på PCR-resultaterne eller måske resultatet-getters. PCR-resultater alene opfylder ikke et behov for at se replikerende virus i en vært, før de tildeler nogen form for kausal rolle til den virus. Men det er ofte upraktisk og ofte unødvendigt, fordi et positivt PCR-resultat generelt er en pålidelig fuldmagt for tilstedeværelsen af aktiv virusinfektion.

dyrkning af et isolat ville heller ikke tildele kausalitet for en pedant. Det beviser bare, at virussen var i patientens prøve. Tilsvarende registrerer et positivt serologiresultat antistoffer mod virussen, hvilket kun beviser, at det blev genkendt af en inficeret patients immunsystem på et tidspunkt. De slags undersøgelser, der er nødvendige for faktisk at bevise årsagssammenhæng, er normalt langt nede på prioritetslisten i en folkesundhedsstyringsfase, som vi er i, når en ny virus opstår. Det bedste væsen (fuldstændig uetisk) menneskelig infektion efterfulgt af infektion af andre primater og derefter flytte ned på relevanslisten til andre furry critters, der kan være en passende stand-in for sygdom hos mennesker.

PCR-reaktionsplade.
foto af David fra Flickr

Der er ikke noget let svar til at løse problemet ovenfor. Meget drejer sig om ord, pedantry, retningslinjer, principper og kriterier. Ofte understøttes disse af mange forskellige epidemiologiske undersøgelser, som alle er stærkt afhængige af gode laboratorieresultater. Resultater som dem, der leveres af PCR. Som vi ved, holder Kochs postulater (bortset fra at anvende bakterier og kun være vejledning) ikke for godt i den molekylære verden af ny og ny virologi. Der er dog ændringer af postulaterne.

andre samlinger som Bradford Hill-kriterierne får mere løb i disse dage. Man kan bestemt ikke teste en Flu eller CoV, der dræber 20-50% af de tilfælde, den findes i, ved hjælp af menneskelige frivillige for at reproducere sygdom og bevise, at agenten var ansvarlig.

Jeg har rullet sammen nogle musings om PCR ‘ s rolle og pålidelighed i en liste.

hvad er PCR (den hurtige version)

PCR er en cyklisk kognings-og køleproces, der forstærker en foruddefineret DNA-strækning ved hjælp af et par lige så foruddefinerede og kommercielt fremstillede oligonukleotider (korte DNA-strækninger), vi kalder primere (de primerer DNA-kopieringsprocessen, der understøtter amplifikationen). Tilføj et omvendt transkriptionstrin på forhånd, og du kan bruge PCR til at forstærke DNA lavet af en foruddefineret RNA-skabelon (skabelon er den ting, vi kopierer og forstærker).

side note #1 – vira kommer med DNA eller RNA genomer. Et positivt PCR-resultat viser ikke aktiv replikation af en virus. Det viser sig ikke smitsom virus er til stede. Derfor foretrækker vi at tale om, at en virus opdages hos patienter, der bruger PCR. Nogle henviser til et PCR – positivt resultat som et “viralt isolat” – ikke. dette bør reserveres for at beskrive eh vellykket vækst af en virus ved hjælp af celle/væv/organkultur.

PCR fordobler antallet af stykker mål-DNA (kopier eller amplicon-hvilket betyder DNA-kopier af en enkelt art) hver cyklus (1 cyklus = runde med opvarmning og afkøling). Jo mere DNA / RNA du starter med (svarer normalt til den virale belastning) i din patientprøve, jo hurtigere får du nok kopier til at blive målt ved hjælp af din valgte detektionsmetode (i dag, for det meste fluorescens signal). Jeg har en side om mekanikken i PCR her

med PCR finder vi virus oftere

for sent, med brug af meget følsomme PCR-metoder i respiratoriske virusundersøgelser er almindelige, forskningsundersøgelser har oftere opdaget virus blandt samplede mennesker uden tegn eller symptomer på sygdom…heller ikke altid umiddelbart før eller efter, hvis folket følges op omhyggeligt. Hvorfor prøve nogen, hvis de ikke er syge? Godt spørgsmål. Du vil måske se, om transmission sker, selvom en sygdom ikke gør det. Men i fortiden, ved hjælp af relativt ufølsomme viruskulturmetoder, ville vi have været mindre tilbøjelige til at opdage en virus.

side note #2 – hvis vi ønsker at erklære en sådan person “asymptomatisk” – vi må hellere være helt sikre på, at de absolut ikke har nogen symptomer på en infektion. Sygdom, en afvigelse fra normal kropsfunktion, kan være så mild som hovedpine eller bare følelse skurk – og stadig, pedantisk, være en sygdom tilskrevet den virus, der opdages ved PCR. Lad os antage, at niveauet af pleje er taget (ofte har det ikke)

side note #3 – Vi går platforme for vira, bakterier og svampe. I 2 børn-92% af 72 prøver indsamlet ugentligt over mere end 250 dage var viruspositive (ingen eller milde tegn på sygdom udviklet i løbet af denne tid)! Det er meget sandsynligt, da vi opdager flere forskellige agenter, bedre karakteriserer dem og udvikler (og bruger) forbedrede kapaciteter, at vi vil lære, at vi næsten aldrig er uden en passager eller 3. Og alligevel er vi ikke altid syge – hvorfor er det?

immunitet kan holde os godt, selvom det er inficeret.

immunsystemet til undsætning! Vi har et meget dygtigt, aktivt og multifunktionelt immunsystem. Det bliver konstant udfordret af … ting – ikke kun vira, bakterier og svampe, men kemikalier, forskellige proteiner, kulhydrater, allergener, snavs og støv (sammensat af bits af alt det andet), og det gør et godt stykke arbejde med at sortere igennem det hele, reagere på hvad det skal, for at forhindre sygdom og normalt klemme svaret på resten på en sådan måde, at vi ikke underpresterer 24/7 på grund af allergi og sygdom. Det er på grund af dette komplekse system, at vi ikke bør blive overrasket over, at da teknologien lader os finde lavere niveauer af smitsomme stoffer, er det helt rimeligt at være “inficeret”, men ikke syg. I det mindste i en del af vores møder med vira, bør dette ikke være nogen overraskelse.

vi får meget eksponering for virus

jeg synes, det er værd at fremhæve, at vi indånder op til 60 liter luft pr.minut med 0,1-7200 submikronpartikler (aerosoliseret; 0,3-0,5 liter) pr. liter. I en undersøgelse blev RNA-RNA fundet oftere i partikler, der var større end 5, end i dem, der var større end 5. Disse små partikler kan indåndes og udåndes forholdsvis let og almindeligt. Dette fremhæver bare, hvor almindeligt det sandsynligvis er for os at indånde vira i vores luftveje

Prøvested og transmission i asymptomatiske tilfælde. Jeg har ingen data til dette, men det ser ud til, at hvis du svaber de øvre luftveje, har du svabbet det sted, hvorfra virus let hostes, nyses og derfor overføres i større partikler. Hvis der opdages en virus der, ser det ud til, at der er en god chance for, at transmission er mulig. Sker det? Disse undersøgelser er ikke let synlige … eller måske er de ikke blevet gjort.

men forureningen!

den store grå peanut-elskende amplicon i rummet er forurening. Det er amplicon fra tidligere PCR-reaktioner, der ved et uheld kommer ind i dine nye PCR-reagenser/pipetter/lab og giver os et positivt resultat, når patienten faktisk ikke er inficeret. Det er, hvad nogle tænker på, når en PCR-positiv forekommer hos en asymptomatisk person. Det er let at pege på dette som en grund til et ubehageligt resultat. Men hvis laboratoriet er ekspert i PCR, vil de nødvendige kontroller være på plads for at advare om forurening.

Plus, for nogle vira og i nogle laboratorier anvendes mere end et PCR-assay, der hver især er rettet mod forskellige genetiske regioner og bruger separate primere. Dette er tilfældet med den anbefalede arbejdsstrøm til MERS-CoV-screening. Det betyder ikke, at det selvfølgelig er de anvendte analyser. Og se efter detaljer om den anvendte testarbejdsgang er altid nyttig til at forstå sammenhængen med et PCR-resultat.

andre nyttige trin inkluderer separate laboratorier til forberedelse af prøver, forberedelse af reaktionsblanding og cykling; laboratorier med retningsbestemt luft – og arbejdsstrømme; engangs alt; kommercielle reagenser; foruddefinerede, målspecifikke sæt (“analytter”); masser af negative kontroller og så videre. Disse giver betydelig tillid til et PCR-resultat og er standard arbejdspraksis for et professionelt diagnostisk PCR-laboratorium. Det er også nyttigt at tage mere end en prøve fra en mistænkt sag.

PCR labs har brug for racks. Farverige stativer sikrer PCR-succes!
Foto fra Madlab Manchester Digital Laboratory på Flickr.

der er meget ekspertise i PCR-verdenen

PCR er blevet brugt til at detektere vira siden 1980 ‘ erne, og der er mange meget kyndige eksperter i brugen, der ved, hvordan man får pålidelige resultater og undgår forurening. Der er også mange publikationer, der forbinder infektiøs virus med et PCR – resultat-PCR-positivitet har betydning, og litteraturen understøtter det.

de af os, der har udført PCR-eksperimenter på humane prøver gennem mange år, vil vide, PCR er ikke så praktisk følsom, at den regelmæssigt vil opdage virus, der bare sidder i næsen, fordi den blev inhaleret, men ikke replikerer. Fortyndingsfaktorer sørger for det.

stadig opstår der problemer, og der findes ikke-professionelle laboratorier. Der er ikke noget let svar på spørgsmålene fra Prof Martin Haditsch på ProMED. Som med enhver test handler pålidelighed om at reducere risikoen for fejl i processen. Men selv ekspertlaboratorier har dårlige dage.

  1. MERS-COV-østlige Middelhav (34): SAUDI-Arabien, hvem http://www.promedmail.org/post/1788112
    sammenhængen mellem akut slap myelitis (AFM) og Enterovirus D68 (EV – D68) – hvad er beviset for årsagssammenhæng?
    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29386095
  2. Enterovirus D68 og akut slap myelitis-evaluering af beviserne for kausalitet
    https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29482893

*importeret indlæg

  1. dette indlæg fra 27jun2013 blev sendt over på min gamle blogplatform virologydownunder.blogspot.com.au. det er nu flyttet til her og let redigeret.

Hits: 9785

Synes godt om indlæsning…

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.