Úvod Do Fixace Pro Histologii: Přemýšlejte, Než Opravíte!

Pro mnoho buněčných nebo tkáňových experimenty, histologie mikroskopie je pravděpodobné, že bude do koncového bodu, a v této sérii článků, chceme ilustrovat, jak některé rozumné názory, pokud jde tkáně nebo buňky, sběr, fixace a zpracování, následné barvení, mikroskopické zobrazování a analýza bude produkovat lepší výsledky.

, Aby zobrazovací jednodušší

například, intenzivní, dobře obarví fluorescenční buňky nebo tkáně bude zobrazovací mnohem jednodušší, ať už jste pomocí widefield, konfokální nebo super resolution mikroskopie. Dobrého zbarvení bude dosaženo použitím vhodných detekčních systémů a vhodně fixovaných buněk nebo tkání.

cílem fixace

cílem fixace je zachování buněk nebo tkání v blízkosti životě jako stavu, jak je to možné, zabránit autolýzy a hnití, a chránit tkáně z následné zpracování. Fixativy mají různé akce, např. síťování, srážecí, koagulační atd. Mají také různé míry penetrace, obvykle měřeno v hloubce proniknuté na mm za hodinu. Jsem obvykle doporučují, kterým se v 20x objem fixačního roztoku do tkáně a opravit pro konzistentní časová období – například, bych normálně opravit vzorky o tloušťce 0,5 cm alespoň v jednom rozměru 24 hodin v Neutrálním Pufrovaném Formalínu, nebo po dobu 6 hodin v Bouinově tekutině. Potom bych před zpracováním převedl vzorky do 70% ethanolu (první fáze v mnoha rutinních protokolech o zpracování parafínu).

jakou teplotu?

teplota je také v úvahu-nízká teplota sníží autolýzu v tkáních, ale povede k pomalejší penetraci, takže si vyberte, co je pro vás důležité. Obvykle fixuji při pokojové teplotě s výjimkami pro tkáň, která má být zpracována na pryskyřici, nebo pro některé citlivé antigeny, kde se doporučuje fixace při nízké teplotě.

Volba závisí na konci

volba fixační přípravek je určen koncový bod – pokud například extrémně vysoký stupeň morfologické zachování je nutné pro světelné nebo elektronové mikroskopie na pryskyřice oddíly, pak je pravděpodobné, že gluteraldehyde fixativ (možná v kombinaci s paraformaldehyd) by být metodou volby. Jako ani jeden z nich jsou účinné při zachování lipidů (který by se ztratil v následném zpracování pryskyřice nebo plast) tkáně by třeba post-opraveno ve oxidem osmičelým.

slovo nebo dvě o glutaraldehydu

protože glutaraldehyd proniká do tkáně pomalu, musely by být kousky tkáně mnohem menší nebo fixační časy mnohem delší. Nicméně, stejně jako mnoho věcí v životě, existuje kompromis pro získání tohoto vysokého stupně morfologické konzervace-obecně je mnohem náročnější provádět empirické barvicí techniky(jako je hematoxylin a Eosin, PAS atd.) nebo techniky sondování molekulárních tkání pomocí protilátek (imunohistochemie atd.) nebo sondami nukleových kyselin (hybridizace in situ) atd.

Brrr-chladný svět kryostatu!

druhým koncem stupnice je použití zmrazených (nebo kryostatových) úseků bez nebo minimální fixace. Například zmrazená část může být vyrobena vzduchem sušená na sklíčku a přímo obarvená. Proto nemá chemickou expozici fixativ nebo alkoholů, rozpouštědel a tepla, které je spojeno se zpracováním parafinu. Demonstrace lipidů, imunohistochemie a imunofluorescence pro určité antigeny a pro mozkovou tkáň, kde může poskytnout vynikající výsledky. Nicméně, obecně horší morfologie získaná pro jiné tkáně celkově činí tento méně mainstream.

politická fixace

stejně jako naši politici se většina z nás snaží apelovat na střední půdu! V současné době je prostřední zemí fixace formalinem fixovaná parafinová vložená tkáň. To je používáno značně v diagnostické patologie – patologové jsou obeznámeni s chromatinu tkání stanovena tímto způsobem, a poskytuje dobrý stupeň zachování morfologické a chemické konzervace tak, že proteiny jsou dobře zachovalé, i když často maskované (které lze vrátit zpět) a mRNA a DNA může být také hybridní odrůdy.

Různých oborů, různých preferencí

Protilátky výrobci často dávají podmínky pro použití na FFPE tkání, pravděpodobně proto, že mají optimalizována a validována těchto činidel na to snadno dostupný typ vzorku. Ale stejně jako politické strany mají různé obory různé preference! Například pro studium makrofágů v jednom z našich výzkumných center je Methacarn fixativem volby.

jedno řešení, které je všechny opraví? Ne tak docela…

Nicméně, jak název říká, „že před vámi opravit“ to neznamená, 4% Neutrální Pufrovaný Formaldehyd je nejlepší ustalovač pro každou aplikaci, to by mohlo být ve skutečnosti škodlivé pro získání nejlepších výsledků v protilátka na základě experimentu, nebo dokonce morfologické zachování. Například na počátku 90. let jsem studoval spermatogenezi, a proto jsem pracoval na varlatech. Varlata je poměrně tekutinou naplněný orgán s heterogenní populací buněk obsažených ve dvou hlavních kompartmentech, tubulech a intersticiu.

Tkáně diktuje fixace

U potkanů existuje 14 stádiích spermatogeneze tak, že v každém průřezu varle semenných tubulů může být charakterizována jako jeden ze 14 etap. Tyto fáze se vyznačují jemnými rozdíly v morfologickém vzhledu různých typů buněk. Ve varlatech, chtěl jsem se podívat na expresi mRNA pomocí in-situ hybridizace – většina literatury doporučuje 4% paraformaldehyd pro in-situ hybridizace, tak co fixační jsem si vybral? Odpověď je samozřejmě, že jsme si vybrali, dobře……… několik! Alespoň pro počáteční hodnocení – důvodem bylo, že jsme mohli vidět z publikované literatury, že paraformaldehyd by nedal stupeň morfologické zachování, který byl potřeba rozpoznat jemné rozdíly v buněčné populace varlete.

desítky let staré, ale stále dává výsledky

Můžeme získat mRNA signál, ale když jsme nemohli přesně určit typ buňky a fázi spermatogeneze, pak získané informace by mělo malý význam. Tak jsme si vybrali několik a nakonec vybrané Bouinova tekutina, která i když to dalo trochu méně citlivé signálu ISH, to dal morfologické zachování potřeboval jsem určit, v jaké fázi spermatogeneze gen byl vyjádřen. Možná jsem měl štěstí, protože tyto 20 let staré vzorky lze ještě dnes použít pro ISH a v mých rukou se ukázalo, že je velmi dobrým fixačním prostředkem pro imunohistochemii.

sát a vidět!

Doporučil bych vám opravit vše v Bouins? Jistěže ne! To bylo ideální fixační pro naše tkáně a požadovaný koncový bod, ale to neznamená, že je ideální pro každou aplikaci. Nalezení ideálního fixačního prostředku může zahrnovat vyzkoušení různých způsobů upevnění vzorků, jejich přípravu různými způsoby a použití různých strategií barvení.

Počáteční základy

Pro většinu aplikací, držet střední cestu, jistě zpočátku, je dobrá strategie pro fixaci, ale pokud je to buď to, že vám koncový bod, který potřebujete, nebo prostě nefunguje, pak mějte otevřenou mysl a prozkoumat různé fixace strategie pro dosažení nejlepších výsledků. Udělejte to blízko začátku projektu, kde máte flexibilitu pro změnu směru.

konečně …

a konečně, jakmile jste provedli fixační volby (např. fixační, čas a teplota) pak udržujte konzistentní a kdo ví, můžete tyto vzorky stále používat Za 20 let!

pomohlo vám to? Pak prosím sdílejte s vaší sítí.

napsal Mike Millar
Image Credit: euthman

Napsat komentář

Vaše e-mailová adresa nebude zveřejněna.